結(jié)核病快速診斷進(jìn)展

1、結(jié)核病快速診斷進(jìn)展,內(nèi)容,結(jié)核病實驗室工作在結(jié)核病控制中的作用為什么要進(jìn)行EQAEQA 培訓(xùn)的重要意義4. 結(jié)核病實驗室相關(guān)的流行病學(xué)理論5. 痰涂片鏡檢的操作原理6. 全球結(jié)核病快速診斷進(jìn)展,結(jié)核病實驗室工作在結(jié)核病控制中的作用,診斷 （發(fā)現(xiàn)傳染源）治療 （確定治療方案）療效評價結(jié)核病控制策略和措施的評估,Diagnosis of Pulmonary TB Relatedto Numbers of Tu

2、bercle Bacilli,,,,10,102,103,104,105,106,,,,,,,,Poor microscopy (25%),Good microscopy (55%),Culture / PCR (25%),X-ray/clinical only (20%),← AFB per ml of sputum,,Slide Courtesy: Van Deun A, Nov 2003,細(xì)菌 – 讓人們聯(lián)想到什么?,疾病傳染性

3、流行性食物腐敗在目前已知的細(xì)菌中有1%的細(xì)菌可以導(dǎo)致人患病在目前已知的細(xì)菌中有4%的細(xì)菌可以導(dǎo)致植物得病 95%已知細(xì)菌不具有致病性,為什么要進(jìn)行EQA,增加人員的責(zé)任心推行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化操作確保實驗室服務(wù)質(zhì)量的提高生物安全的需要加強(qiáng)實驗室網(wǎng)絡(luò)、采集信息,痰涂片鏡檢EQA 培訓(xùn)的意義,強(qiáng)化EQA的理解，有利于積極推廣提高實驗室服務(wù)質(zhì)量提高對結(jié)核病實驗室工作的重視逐步提高結(jié)核病防治人員特別是結(jié)核病實驗室工作人員

4、的地位,結(jié)核病實驗室相關(guān)的流行病學(xué)理論,結(jié)核病的發(fā)病學(xué)和流行冰山理論水庫理論病因分析和療效評價,核分枝桿菌在人體中的生活周期,,,,,,,,,,,,,,感染,感染 – 95%,后期表現(xiàn) - 5%,,,病變早期進(jìn)展 - 5%,,例如： HIV, 嬰幼兒,例如：移民,結(jié)核分枝桿菌的生活周期,,,,,,,,,,,,,感染,人體內(nèi)生存,由肺中排入空氣中,,,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)侵犯人體免疫防御系統(tǒng),免疫激活和營養(yǎng)限制,免疫病理,釋放調(diào)控因子, 例

5、如 sigma factors,釋放抗原性蛋白,改變營養(yǎng)需要,改變細(xì)胞壁,,,,微生物和人類,,Very few microbes are,always pathogenic,Many microbes are,potentially pathogenic,Most microbes are,never pathogenic,,,,,potential pathogen isolated from or detected in clin

6、ical samples,,,,,,,,,Recognised syndromes,patient's clinical condition,e.g.,septicaemia, endocarditis,,osteomyelitis meningitis,,UTI, pneumonia,pharyngitis,,我們?nèi)绾沃捞囟ǖ牟≡⑸镏虏?,診斷和有效的治療不僅依靠分離病原微生物，而且在于建立實驗室和病人臨床癥狀的聯(lián)系,,

7、,如何推測特定病原體可以致病?,Koch‘s 推測病原體必須在每一例病例中都出現(xiàn)病原體可以從宿主中分離并且可以在純培養(yǎng)基中生長當(dāng)特定的病原體接種到健康機(jī)體時特定的疾病會發(fā)生病原微生物可以在實驗動物中恢復(fù),,,Spectrum of virulence,poliomyelitis in a child,0.1-1% of infections are,clinically apparent,,,,rubella,50% of in

8、fections are,clinically apparent,rabies,100% of infections,are clinically apparent,,,,,,,,,,,,,,傳染性疾病的冰山理論,asymptomatic infection,classical,clinical disease,less severe,disease,水庫理論,,,,,發(fā)病人數(shù),死亡人數(shù),治愈人數(shù),現(xiàn)有病人數(shù),痰涂片鏡檢的操作原理,分枝

9、桿菌的發(fā)現(xiàn)歷史,1590 年荷蘭楊森父子發(fā)明了顯微鏡19世紀(jì)末,顯微鏡技術(shù)、染色技術(shù)已應(yīng)用于微生物檢測,分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)條件已成熟在發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌前,科霍已是一位在微生物學(xué)方面取得豐碩成果的學(xué)者.,Robert Koch – 第一個證明細(xì)菌可以致病,1876傳染病的微生物病因?qū)W病因?qū)W - 疾病的病因建立 “科學(xué)規(guī)則” 來確定微生物和疾病的病因和效應(yīng)關(guān)系Koch’s 原理,Koch確定了3個重要疾病的病因,1. 霍亂 (fec

10、al-oral disease)Vibrio cholerae2. 結(jié)核病 (pulmonary infection)Mycobacterium tuberculosis3. 炭疽(sheep and cattle)Bacillus anthracis,結(jié)核病,Figure 24.9,結(jié)核分枝桿菌：棒狀抗酸菌. 可以在人與人之間傳播牛型結(jié)核桿菌: 美國的病例數(shù)〈１％,不在人與人之間傳播鳥胞內(nèi)分枝桿菌，可以感染 AIDS

11、晚期患者,光學(xué)顯微鏡的基本原理,為區(qū)分物體不同的兩點(diǎn),這兩點(diǎn)的光學(xué)成像必須落在視網(wǎng)膜上不同的感光細(xì)胞上;顯微鏡下,光線經(jīng)過顯微鏡物鏡折射成倒立放大的實像,然后經(jīng)目鏡折射成正立放大的虛像;經(jīng)顯微鏡放大后,人眼就可以區(qū)分物體不同的兩點(diǎn),以達(dá)到觀察微小物體的目的;由于光線衍射的原因,普通光學(xué)顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體；,分辨率和對比度,人的肉眼不能看清小于0.1毫米的物體普通光學(xué)顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體電

12、子顯微鏡不能看清小于0.1納米的物體,電子顯微鏡下的結(jié)核分枝桿菌,生理條件下細(xì)菌的表面往往帶有大量負(fù)電荷,原因：細(xì)菌表面帶有正負(fù)電荷的基團(tuán)，等電點(diǎn)多在PH７以下，因此在中性或堿性條件下細(xì)菌的表面往往帶有大量負(fù)電荷,染色反應(yīng),Stains - salts composed of a positive and negative ion, one of which is colored (chromophore)堿性染料 – 著色基團(tuán)帶正

13、電荷dye+ Cl-酸性染料 – 著色基團(tuán)帶正電荷Na+ dye-,分枝桿菌涂片鏡檢基本原理,１、待檢標(biāo)本中存在分枝桿菌，即受檢者排菌２、分枝桿菌的特殊結(jié)構(gòu)決定了染色方法：　　　染色劑 細(xì)菌表面帶負(fù)電荷,與堿性復(fù)紅易于結(jié)合,　　　　加熱 加深分枝桿菌著色程度　　　　脫色 為了易于鏡檢，應(yīng)該使抗酸菌以外的所有物質(zhì)近乎完全脫色　　　　復(fù)染 提供一個良好的對比，隱去背景中殘留的紅色，但

14、不掩蓋抗酸菌。而且，復(fù)染既要使涂片的背景易于鏡檢時調(diào)焦，同時又不能太深以至分散太多注意力,結(jié)核菌感染及排出示意圖,結(jié)核病,結(jié)核病,細(xì)胞壁,革蘭氏陽性菌,革蘭氏陰性菌,分枝桿菌,脂質(zhì)雙分子,肽聚糖,MYCOLATE,lipid + LPS,porins,acyl lipids,arabinogalacta,LAM,細(xì)胞膜,兩種主要結(jié)構(gòu)成分雙層磷脂　double layer of phospholipids蛋白質(zhì)　　proteins,1

15、. 痰涂片操作程序原理2. 二甲苯問題,假陰性 假陽性技術(shù)錯誤 涂片: 太薄/太厚、暴露在紫外線下 標(biāo)本中的混雜物質(zhì) / 加熱時間過長

16、 / 使用污染的木簽 染色: 染色質(zhì)量不佳、未熱染、染色時 結(jié)晶/環(huán)境抗酸菌、 間太短、脫落、涂片未固定 交叉污染 脫色: 脫色不佳 脫色不佳 復(fù)染: 過染

17、 染色不佳鏡檢員 視力缺陷、僅觀察少數(shù)視野、 經(jīng)鏡油交叉污染讀片錯誤： 未經(jīng)培訓(xùn) 未經(jīng)培訓(xùn)記錄/報告： 記錄錯誤 記錄錯誤,產(chǎn)生錯誤結(jié)果的常見原因,,,,,,,,細(xì)菌感

18、染的診斷,,病人,臨床診斷,血液生化,Non-microbiological investigations,影像學(xué),,,,,,標(biāo)本,分泌物 標(biāo)本,,實驗室檢查是臨床診斷的必要環(huán)節(jié),OUTLINE,細(xì)菌學(xué)診斷 顯微鏡檢查術(shù) 培養(yǎng)免疫學(xué)診斷分子生物學(xué)診斷 Gen Probe 噬

19、菌體檢測方法 HPLC 其他,結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌學(xué)診斷,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,培養(yǎng),,,,,,,,,,on

20、 plates or in broth,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,顯微鏡檢查,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,脫色,,,,,復(fù)染,,,,,,染色

21、,unstained or stained with e.g. Gram stain,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,藥敏,,,,,,,,,,血清學(xué),DNA 方法,by disc diffusion methods, breakpoints or MICs,,,,顯微鏡檢查,Gram-染色抗酸染色Ziehl-Neelsen熒光染色Direct, e.g. auramineImmunofluorescenc

22、e,培養(yǎng),Solid mediaAgar platesFor IdentificationFor EnumerationSlopesFor safe long-term culture, e.g. Lowenstein-Jensen media for TBLiquid media (broth)For enrichment or maximum sensitivity,菌種鑒定,形態(tài)學(xué)生長條件生化反應(yīng)酶抗原分子

23、生物學(xué)方法,非培養(yǎng)的診斷方法,血清學(xué)檢測分子生物學(xué)方法其他（HPLC）,什么是分子生物學(xué)診斷方法 ?為什么用分子生物學(xué)診斷方法 ?可得的分子生物學(xué)方法?,,42,討論的議題,分子生物學(xué)方法是傳統(tǒng)方法的必要補(bǔ)充,顯微鏡檢查有假陽性 - T.vaginalis, N.gonorrhoeae胞內(nèi)致病菌 – viruses, M.genitalium 低敏感性 – Ch

24、lamydia sp.,Neisseria sp.慢速生長 – M. tuberculosis,分子生物學(xué)方法 – 如何發(fā)揮作用?,每個微生物擁有一些種屬特異的DNA序列分子生物學(xué)方法使得種屬特異性DNA可以衡量法醫(yī)鑒定,分子生物學(xué)方法是一系列DNA初級結(jié)構(gòu)的方法,雜交的互補(bǔ)序列方法,擴(kuò)增合成種屬特異的DNA序列,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,- T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C-,,-A-A

25、-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-,PCR 實驗室,,,,,,,,,標(biāo)本處理DNA 準(zhǔn)備,潔凈屋儲存溶液,混合點(diǎn),熱循環(huán)和擴(kuò)增,檢測,,QC & QA質(zhì)量控制 和質(zhì)量保證,,R & D,,,,,Alternatives:

26、 - commercial kits - robots + kits,No alternative,①Bactec放射呼吸測定 以含有放射標(biāo)記的軟脂酸為底物的液體培養(yǎng)基，自動測量分枝桿菌代謝14C軟脂酸脫致過程中釋放的14CO2的量。該法藥敏報告可縮短為4一12天。 ②分枝桿菌生長指示管法 Bactec放射呼吸測定法的替代方法。以培養(yǎng)基中加入熒光釕復(fù)合物代替放射性標(biāo)記，其熒光衰減與細(xì)菌代謝過程中O2的消耗量有關(guān)。熒光衰

27、減可通過一系列不同的紫外透照管檢測。,Bactec呼吸測定,流式細(xì)胞儀測定法,原理: 分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)的非特異性脂酶能水解培養(yǎng)基中加入的熒光素復(fù)合物(FDA)為游離的熒光素，因而分枝桿菌在生長過程中可造成熒光素的堆積，經(jīng)FCM即可檢測到。,比色法,①M(fèi)TT法 MTT法為線粒體琥珀酸脫氫酶的作用底物，可被活細(xì)胞還原形成不溶性的Formazan產(chǎn)物,其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。Formazan經(jīng)溶解后，可在酶標(biāo)儀上測定其光吸收值。

28、②微孔板美蘭比色法 美蘭為耗氧指示劑，有氧時為藍(lán)色，無氧時為粉紅色。Franzblau等以美蘭為指示劑在96孔微量板中培養(yǎng)細(xì)菌，培養(yǎng)基中加入抗結(jié)核藥物，微量板用Parafilm封口膜封閉。若細(xì)菌為藥物敏感株，可被加入的抗結(jié)核藥物抑制或殺死，首先表現(xiàn)為氧消耗停止。而耗氧指示劑在各獨(dú)立微小隔氧環(huán)境中的頗色變化可客觀反映氧被消耗的程度，從而反映細(xì)菌的生長狀態(tài)。,噬菌體生物擴(kuò)增法 將分枝桿菌噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌，未進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體用特

29、異的杭噬菌體物質(zhì)滅活，進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體得到保護(hù)而復(fù)制增殖，溶菌后釋放子代噬菌體，將此噬菌體與快速生長的恥垢分枝桿菌混合，接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察蝕斑的產(chǎn)生。蝕斑的數(shù)量與噬菌體數(shù)量有關(guān)，也與在含抗結(jié)核藥物培養(yǎng)基上存活的結(jié)核分枝桿菌數(shù)有關(guān)。,噬菌體法（Fast flaque),噬菌體熒光素酶檢測法 Jacobs等將熒火蟲熒光素酶基因?qū)敕种U菌噬菌體，這種噬菌體感染分枝桿菌后，熒光素酶基因被代謝活躍的分枝桿菌活化，在菌細(xì)胞內(nèi)ATP存

30、在的條件下，可產(chǎn)生光子，通過熒光檢測器測定發(fā)光信號。只有耐藥的分枝桿菌才能在含藥的培養(yǎng)墓上生長，產(chǎn)生光子，敏感菌和死亡菌不產(chǎn)生或產(chǎn)生后不能維持。,噬菌體生物擴(kuò)增法原理示意圖,Gen Probe 方法檢測結(jié)核分枝桿菌,1.原理2.菌種鑒定,RNA/RNA錯配法 Nash等(1997)首先將該法用于RFP耐藥菌株培養(yǎng)物的檢測。該法是基于雙鏈RNA能抵杭RNA酶的消化的原理而建立的。將待檢菌株以及藥物敏感的參考菌株(H37Rv)的PCR產(chǎn)物

31、混合，加入T7RNA多聚酶和SP6RNA多聚酶，通過轉(zhuǎn)錄形成兩條RNA，在進(jìn)行雜交，若待檢測株為敏感株，則形成兩條互補(bǔ)的RNA，能抵抗RNA酶的消化，若待檢測菌株有突變發(fā)生，則不能與參考株RNA鏈完全配對，加入RNA酶后，雜交產(chǎn)物將在突變位點(diǎn)被切開，通過電泳即可檢測到。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Russia,Brazil,Tokyo,Sweden,Birkhaug,Danish,Prague,Glaxo,Tice,Frapp

32、ier,Connaught,Phipps,Pasteur,分枝菌酸(HPLC),Alpha,Methoxy,Keto,,,,300 bp,,200 bp,,100 bp,,Behr et al. J Bacteriol, 2000,DNA 測序法,Hirano等應(yīng)用DNA測序法 DNA測序法被認(rèn)為是檢測變異的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可檢測出待檢基因上的所有突變位置和突變情況。利用PCR法擴(kuò)增待檢基因，PCR產(chǎn)物可直接測序，24一48h即可提供精確序

33、列，并準(zhǔn)確判定堿基突變的位點(diǎn)，已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐藥基因的檢測。,基因芯片,基因芯片 將耐藥基因的DNA或寡核苷酸序列標(biāo)記到芯片上，從而快速的檢測出突變位點(diǎn)，可以在3個小時內(nèi)完成。,基因組學(xué)的問題,多樣性 單核苷酸多態(tài)性,復(fù)制子,缺失,重排株水平差異和種屬特異性基因的作用是什么?基因的功能通常是未知的主要是根據(jù)同類中的功能來推論翻譯成效應(yīng)分子信息如何引導(dǎo)診斷、預(yù)防、治療疾病,M. tubercu

34、losis H37Rv,440萬堿基對 3924 預(yù)測基因 65.6 % GC 含量,Cole ST et al. Nature 1998; 393: 537.,斑點(diǎn)雜交和反相斑點(diǎn)雜交,,斑點(diǎn)雜交,,,DNA / RNA 標(biāo)本,標(biāo)記探針,,,反相斑點(diǎn)雜交,,,探針,標(biāo)記DNA / RNA 標(biāo)本,制作DNA芯片,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

35、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,96-孔板,,,,,,,,,,,,,‘printer’,玻片,,,,18mm,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA在玻片上的點(diǎn)樣,,,DNA 微陣列 - M. tuberculosis H37Rv的基因組芯片,3924 開放閱讀框一個基因一個探針,DNA微陣列,,,,,Cy3,Cy5,DNA /RNA,DN

36、A /RNA,,,,,,,,,,,,,,,,DNA 微陣列,,,掃描,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,cDNA 微陣列,Cy3 和 Cy5 熒光強(qiáng)度相等

37、,,,,Cy3 熒光信號強(qiáng),Cy5 熒光信號強(qiáng),,,,,Rv562,Rv2875,Rv780,Rv1974,Rv1976,Rv1978,M. tuberculosis vs. BCG-Danish 1331,H37Rv,BCG,Both strains,Behr MA et al. Science 1999; 284:1520.,Affymetrix 基因芯片,ACGT,ACGT,Genomic Sequence,‘C’