基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)目錄目錄實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的培養(yǎng)..........................................................................................................................2實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA的提取.................................................................

2、............................................3實(shí)驗(yàn)三紫外吸收法測(cè)定核酸濃度與純度......................................................................................4實(shí)驗(yàn)四水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA....................................................

3、........................5實(shí)驗(yàn)五質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定...........................................................................7實(shí)驗(yàn)六植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析.....................................................................8實(shí)驗(yàn)七聚合酶鏈反

4、應(yīng)（PCR）技術(shù)體外擴(kuò)增DNA..................................................................9實(shí)驗(yàn)八RNA提取與純化............................................................................................................11實(shí)驗(yàn)九RTPCR擴(kuò)增目的基因cDN

5、A.......................................................................................13實(shí)驗(yàn)十質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng).................................................................................15實(shí)驗(yàn)十一感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化..............

6、..........................................................................16實(shí)驗(yàn)十二克隆的篩選和快速鑒定................................................................................................18實(shí)驗(yàn)十三DNA分析——Southern雜交...........

7、...........................................................................19一基本操作實(shí)驗(yàn)一、細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)二、質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)三、紫外吸收法測(cè)定核酸濃度與純度實(shí)驗(yàn)四、水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA實(shí)驗(yàn)五、質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定實(shí)驗(yàn)六、植物基因組DNA提取、定量、酶切及電泳分析實(shí)驗(yàn)八、植物RNA提取及純化二、目的基因獲取實(shí)驗(yàn)七、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（P

8、CR）技術(shù)體外擴(kuò)增DNA實(shí)驗(yàn)九、RTPCR擴(kuò)增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表達(dá)實(shí)驗(yàn)十、質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng)實(shí)驗(yàn)十一、感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)十二、克隆的篩選和快速鑒定實(shí)驗(yàn)十三、DNA分析——Southern雜交（１）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1、過(guò)夜培養(yǎng)⑴取5ml液體培養(yǎng)基加入一只無(wú)菌的試管中。⑵用接種環(huán)或滅菌牙簽挑一個(gè)單菌落，接種于培養(yǎng)液中。⑶蓋好試管，在搖床上以60rmin速度，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。２、大體積培養(yǎng)⑴按1∶1

9、00的比例將過(guò)夜培養(yǎng)物加入到一無(wú)菌燒瓶中，燒瓶的體積應(yīng)該是培養(yǎng)液體積的5倍以上。⑵于37℃，約300rmin劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)。（２）在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)主要是為了獲得單菌落和短期保存。平板劃線法分離單菌落⑴采用無(wú)菌技術(shù)，用接種環(huán)將接種物從平板的一側(cè)開(kāi)始劃線。⑵重新消毒接種環(huán)，從第一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分，重復(fù)劃線直至覆蓋整個(gè)平板。⑶于37℃培養(yǎng)直至長(zhǎng)出單菌落。實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取的提取目的目的學(xué)習(xí)堿

10、裂解法提取質(zhì)粒的原理原理原理質(zhì)粒（plas）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，具有雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA分子。它具有自主復(fù)制能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳信息。目前，質(zhì)粒已廣泛用作基因工程中目的基因的運(yùn)載工具——載體。質(zhì)粒DNA的提取是依據(jù)質(zhì)粒DNA分子較染色體DNA分子小，且具有超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的特點(diǎn)，從而將質(zhì)粒DNA與大腸桿菌染色體DNA分離?，F(xiàn)在常用的方法有：堿裂解法、密度梯度離心法、煮沸裂解法等。實(shí)驗(yàn)室普

11、遍采用的堿裂解法具有操作簡(jiǎn)便、快速、得率高的優(yōu)點(diǎn)。其主要原理：利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。在堿變性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)而變性，質(zhì)粒DNA氫鍵也大部分?jǐn)嗔?，雙螺旋也有部分解開(kāi)，但共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)pH=4.8的乙酸鈉將其pH調(diào)到中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，由于浮力密度不同，染色體DNA