補腎排毒合劑對瘦素神經(jīng)內(nèi)分泌軸的影響

1、,補腎排毒合劑對慢性腎衰竭大鼠 瘦素—神經(jīng)內(nèi)分泌軸的影響,青島市中醫(yī)醫(yī)院 于俊生,研究的目的和意義,近年來,瘦素（Leptin）、瘦素受體及神經(jīng)肽Y（NPY）與慢性腎功能衰竭營養(yǎng)不良的關(guān)系引起了國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注，本實驗運用免疫組化方法，觀察了補腎排毒合劑對慢性腎衰竭營養(yǎng)不良大鼠Leptin及NPY代謝的影響，旨在探討補腎排毒合劑治療慢性腎衰竭營養(yǎng)不良的機(jī)理。,研 究 方 法,實 驗 試 劑,SABC免疫組化試劑

2、盒瘦素兔抗人多克隆抗體、瘦素受體兔抗人多克隆抗體（Ob-Ra、Ob-Rb通用），NPY兔抗人多克隆抗體（由博士德生物工程有限公司提供）,實 驗 藥 品,補腎排毒合劑：由柴胡、黃芩、太子參、生地、大黃、六月雪等藥物經(jīng)水煎熬汁、濃縮而成。 生藥含量為2.71 g/ml。由青島市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。,實 驗 動 物,Wistar大鼠60只，雌雄各30只，體重240-280g，由青島市動物研究所提供。于室溫23℃，用標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼

3、料分籠喂養(yǎng)，自由飲水。相同條件喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組：正常對照組（Ⅰ組）15例、慢性腎功能衰竭組（Ⅱ組）22例、慢性腎功能衰竭灌胃組（Ⅲ組）23例。,建 立 動 物 模 型,正常對照組行假手術(shù)。慢性腎衰組：采用兩步部分腎切除法，首先梯形切去左腎兩極，四周后行右腎全切。慢性腎衰灌胃組：兩步部分腎切除法同腎衰組，術(shù)后六周模型成熟開始予補腎排毒合劑灌胃，持續(xù)6周。,標(biāo) 本 收 集 與 病 理 切 片,三組大鼠均于術(shù)后12周行脫頸椎

4、處死，取頭背部“丁”字型切開皮膚，去掉顱骨，取出整個腦組織，沿矢狀面切開，保存。刨開腹腔，取出脂肪組織和左腎組織。取出組織用10%甲醛固定；清水洗滌，逐級酒精脫水；然后浸蠟，石蠟包埋，制作3μm厚的連續(xù)切片。,免 疫 組 化（SABC法）,58℃烤片過夜，梯度乙醇脫蠟至水。滴加3%H2O2，濕盒內(nèi)室溫放置20min，單蒸水洗。滴加復(fù)合消化液，37℃放置1小時，0.01MPBS洗。滴加血清封閉液，置于濕盒內(nèi)，室溫放置20min，甩

5、去多余液體。滴加適當(dāng)稀釋的一抗，置于濕盒內(nèi)，4℃過夜。0.01MPBS。滴加生物素化羊抗兔IgG，置于濕盒中，37℃放置20min。滴加試劑SABC，37℃，20min，0.01MPBS洗次。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。,結(jié) 果 判 定,每組切片隨機(jī)選取5個區(qū)域，每個區(qū)域包含100個同類細(xì)胞，計量陽性細(xì)胞，取平均數(shù)作為每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)。,統(tǒng) 計 學(xué) 方 法,計量資料結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，先采用方

6、差齊性檢驗，再用兩兩t檢驗，用Excel統(tǒng)計軟件處理，p<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。,結(jié) 果,Leptin在脂肪組織的表達(dá),P1：與Ⅰ組比較， P2：Ⅱ組與Ⅲ組比較,Ob-R在腎臟的表達(dá),P1：與Ⅰ組比較，P2：Ⅱ組與Ⅲ組比較,Ob-R在下丘腦的表達(dá),P1：與Ⅰ組比較，P2：Ⅱ組與Ⅲ組比較,NPY在下丘腦的表達(dá),P1：與Ⅰ組比較，P2：Ⅱ組與Ⅲ組比較,討 論,瘦素與瘦素--神經(jīng)內(nèi)分泌軸,Lepti

7、n主要在脂肪和胎盤組織合成，是由167個氨基酸組成的一種分泌型蛋白質(zhì)。Leptin通過其受體作用于不同組織，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，受體中作用明確而且最重要的是長型受體（Rb）和短型受體（Ra）。腎臟是清除Leptin的重要器官。瘦素-神經(jīng)內(nèi)分泌軸：Leptin與Ra結(jié)合通過血腦屏障，在下丘腦與Rb結(jié)合，通過雙向激活激酶（JAK）或信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白（STAT）途徑進(jìn)行信號傳導(dǎo)，影響神經(jīng)肽Y(NPY)等多種神經(jīng)內(nèi)分泌激素的分泌，調(diào)節(jié)食欲及

8、機(jī)體能量消耗，改變營養(yǎng)狀態(tài)。,瘦素--神經(jīng)內(nèi)分泌軸與CRF營養(yǎng)不良,實驗結(jié)果顯示CRF大鼠Leptin-神經(jīng)內(nèi)分泌軸存在明顯異常。脂肪組織Leptin表達(dá)增高，腎臟Ob-R表達(dá)降低， 使Leptin的排出減少，造成高瘦素血癥。中樞Ob-R活性增強，Leptin通過血腦屏障向下丘腦轉(zhuǎn)運的量增加。相對較多的Leptin進(jìn)入下丘腦，通過表達(dá)增強的Rb，抑制了NPY的分泌。大鼠食物攝入減少，體重降低，進(jìn)而逐漸出現(xiàn)營養(yǎng)不良。,補腎排毒合劑對瘦素

9、 --神經(jīng)內(nèi)分泌軸的影響,用藥組Leptin在脂肪組織較腎衰組表達(dá)略有減少。腎組織中Ob-R表達(dá)較腎衰組增強。腦中Ob-R的表達(dá)強度較腎衰組減弱，NPY的表達(dá)增強。補腎排毒合劑使腎臟對leptin的降解排出增多。同時調(diào)整機(jī)體細(xì)胞代謝，改善胃動力，飲食增加，反饋性抑制leptin受體活性。隨著腦中Ob-R的表達(dá)強度減弱，進(jìn)入腦組織leptin的量及其對NPY的抑制作用減輕，NPY的合成分泌增加，使食欲增強，蛋白、脂質(zhì)合成增加，從而改善