論文答辯模板胰腺炎中細(xì)胞凋亡的調(diào)控

1、匯報(bào)者： 組 員：,在蛙皮素誘導(dǎo)大鼠的急性胰腺炎中GRP78和XIAP與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,文獻(xiàn)來(lái)源(Sources of Literature),內(nèi)容目錄(Table of Contents),,,1 背景(Introduction),,,2 研究目的(Aim of Research),,,3 材料和方法(Materials and methods),,,4 結(jié)果(Results),,,

2、5 討論(Discussion),背景(Introduction),急性胰腺炎(AP)是胰腺的一種炎癥性疾病，其發(fā)病率和死亡率相當(dāng)高，但是至今對(duì)其的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚。近年來(lái)一些研究表明胰腺腺泡細(xì)胞的死亡包括壞死和凋亡兩種，而且其嚴(yán)重程度與細(xì)胞壞死的程度直接相關(guān)，與細(xì)胞凋亡的程度呈負(fù)相關(guān)。細(xì)胞凋亡的主要途徑中通過(guò)激活凋亡蛋白酶(caspases)，其特異水解一套蛋白底物,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)caspases與其抑制劑

3、總是共存的，以免Caspases酶原被意外激活，對(duì)正常細(xì)胞造成損傷。XIAP和GRP78就是例子。,背景(Introduction),X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)IAP家族中的主要成員，是IAP家族中最強(qiáng)的凋亡抑制因子，它可直接抑制caspases并可多途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protei

4、n 78，GRP78)，又名免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)或人70kDa熱休克蛋白5(HSPA5)，不僅是主要的分子伴侶，也具有抗凋亡的作用。,研究目的(Aim of Research),本實(shí)驗(yàn)主要研究GRP78和XIAP在蛙皮素誘導(dǎo)的急性胰腺炎中參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的可能作用。,材料和方法(Materials and methods),雄性Wistar大鼠36只，體重在200-220g,蛙皮素誘導(dǎo)胰腺炎組,鹽水對(duì)照組6只,按取樣時(shí)間,

5、隨機(jī),,,,,,,24h6只,6h6只,12h6只,3h6只,,,1h6只,,,,,,,,,,,,胰腺組織水腫的評(píng)估,血清淀粉酶和脂肪酶的測(cè)定,胰腺組織學(xué)檢查,凋亡指數(shù)的測(cè)定,GRP78、XIAP、caspase-3、 caspase-7、 caspase-9的表達(dá)測(cè)定,蛙皮素， 50μg/kg，腹腔注射，共4次，每次間隔1h,鹽水，同理,,,,,最后一次注射后，按取樣時(shí)間處死大鼠，取出新鮮胰腺、抽取下腔靜脈血,,數(shù)據(jù)整理及分

6、析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（ 𝒙 ±SE）；兩組均數(shù)之間的比較采用兩樣本的t檢驗(yàn)；必要時(shí)可計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)。P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析使用的軟件是SPSS 13.0。,材料和方法(Materials and methods),材料和方法(Materials and methods),大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：23℃，12h白/晚，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，不禁水。血清淀粉酶

7、和脂肪酶的測(cè)定方法：大鼠處死后，抽取下腔靜脈血，4℃下離心，將血清儲(chǔ)存在-80℃，進(jìn)行ELISA測(cè)定血清淀粉酶和脂肪酶。胰腺組織水腫的評(píng)估方法：首先將取出的新鮮胰腺立即稱(chēng)重（濕重），然后放入干燥箱中在80℃條件下干燥72h，然后再次稱(chēng)重（干重）。通過(guò)計(jì)算組織含水量來(lái)評(píng)估胰腺組織水腫的情況。 （濕重-干重）/濕重×100%,材料和方法(Materials and methods),胰腺的組織學(xué)檢查方法：按常規(guī)組織學(xué)檢

8、查，10%福爾馬林固定，石蠟包埋后做成4μm的切片，然后進(jìn)行HE染色。凋亡指數(shù)的測(cè)定方法：使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將之前準(zhǔn)備好的組織學(xué)切片放在37℃的TUNEL反應(yīng)混合物中孵育1小時(shí)。最后，通過(guò)熒光顯微鏡（波長(zhǎng)為450-500nm）進(jìn)行分析，使用圖像采集系統(tǒng)獲取圖像。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯示明亮的綠色熒光。凋亡指數(shù)(AI)：對(duì)每張片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野，并計(jì)算每個(gè)視野的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，求10次的平

9、均值所得。,實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法：取每只大鼠的新鮮胰腺組織50-80mg，用TRIzol分離出總的RNA。取總的RNA 5μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物取1μg在引物的作用下進(jìn)行PCR。引物序列如下：GRP78: 5'-GAAACTGCCGAGGCGTAT-3' / 5'-ATGTTCTTCTCTCCCTCTCTCTTA-3'; Caspase-3: 5'-CGGACCT

10、GTGGACCTGAAA-3' / 5'-GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3'; Caspase-7: 5'-TCTATGTGCCCCGTCAGTA-3' / 5'-ACATCCATACCTGTCGCTTT-3';Caspase-9: 5'-ACGACCTGACTGCTAAGAAA-3' / 5'-AGCCATGAGAGAGGATGAC-3'

11、;;XIAP: 5'-TGTGAGTGCTCAGAAAGATAAT-3' / 5'-TGCTTCTGCACACTGTTTACA-3'; β-actin: 5'-CGTGAAAAGATGACCCAGAT-3' / 5'-ACCCTCATAGATGGGCACA-3',材料和方法(Materials and methods),Western blot檢測(cè)提取總蛋白：用二辛

12、可寧酸性蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定其濃度。電泳：將其分成每20μg一份，經(jīng)過(guò)12%的鈉十二烷基硫酸鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯二氟化膜上。 封閉：5%的乳粉溶液將膜封閉2h。  一抗孵育：實(shí)驗(yàn)組加入多克隆GRP78和單克隆XIAP（1:1000的稀釋液），對(duì)照組加入單克隆兔抗大鼠β-actin抗體（1:1000的稀釋液）孵育過(guò)夜。二抗孵育：洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1:500

13、0的稀釋液）在室溫孵育2h。蛋白質(zhì)檢測(cè)：通過(guò)儀器檢測(cè)生成可視圖像。,材料和方法(Materials and methods),1、蛙皮素誘導(dǎo)胰腺炎的情況結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在3h時(shí)血清淀粉酶及脂肪酶均有明顯的升高，并分別在6h和12h達(dá)到高峰，24h時(shí)趨于正常。(P<0.05),結(jié)果(Results),血清淀粉酶,血清脂肪酶,2、胰腺水腫的評(píng)估結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在1h時(shí)的

14、組織含水量有明顯的升高，在6h時(shí)達(dá)到高峰，此后逐漸下降，24h時(shí)趨于正常。(P<0.05),結(jié)果(Results),3、胰腺組織學(xué)檢查,結(jié)果(Results),結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，胰腺炎的胰腺組織表現(xiàn)的是間質(zhì)水腫、空泡細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞的滲透。6h時(shí)間質(zhì)水腫和空泡細(xì)胞最明顯；12h時(shí)間質(zhì)中炎性滲出最明顯。,結(jié)果(Results),TUNEL染色,4、凋亡指數(shù)(AI)的測(cè)定結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組AI在3h

15、時(shí)有顯著的升高，在6h時(shí)達(dá)高峰，之后逐漸下降，但24h時(shí)仍有顯著升高。(P<0.05),結(jié)果(Results),5、急性胰腺炎時(shí)caspases的基因表達(dá)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中caspase-3，-7，-9的mRNA水平在1h時(shí)均有顯著升高，在6h時(shí)達(dá)到高峰，之后逐漸下降，24h時(shí)趨于正常。(P<0.05),結(jié)果(Results),6、急性胰腺炎時(shí)GRP78的表達(dá)結(jié)果顯示：與對(duì)照

16、組相比，實(shí)驗(yàn)組中GRP78 mRNA的水平在1h時(shí)急劇降低，在3h時(shí)達(dá)到最低，之后逐漸升高，24h趨于正常水平。(P<0.05),結(jié)果(Results),7、急性胰腺炎時(shí)XIAP的表達(dá)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中XIAP mRNA的水平在3h時(shí)明顯降低，之后一直到24h均處于低水平。(P<0.05),結(jié)果(Results),GRP78與凋亡指數(shù)及caspase-3，-7，-9呈負(fù)相關(guān)。 (Pearson

17、相關(guān)系數(shù)分別為-0.757，-0.669，-0.871，-0.704， P<0.05)XIAP與凋亡指數(shù)及caspase-3，-7，-9也呈負(fù)相關(guān)。(Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.911，-0.950，-0.827，-0.855， P<0.05),結(jié)果(Results),1、在蛙皮素誘導(dǎo)大鼠的急性胰腺炎中，GRP78和XIAP均降低，且與凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明GRP78和XIAP與胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡有

18、關(guān)，而且起著抗凋亡的作用。2、GRP78和XIAP的表達(dá)與caspase基因的表達(dá)和凋亡指數(shù)(AI)均呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明GRP78和XIAP在蛙皮素誘導(dǎo)大鼠的急性胰腺炎中負(fù)性調(diào)控caspase的激活，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。3、 從結(jié)果看在蛙皮素誘導(dǎo)大鼠的急性胰腺炎中GRP78和XIAP抗凋亡的作用很明顯，但這兩者之間是否存在著相互作用關(guān)系，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。,討論(Discussion),大鼠胰腺組織水腫的評(píng)估與其他檢測(cè)是怎么分配的？