Hedgehog信號通路在大鼠急性胰腺炎腺泡細胞凋亡中的作用.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種由多種病因?qū)е碌募毙匝装Y反應(yīng)，起病急驟，臨床表現(xiàn)多樣，輕度患者治療后短期內(nèi)即可恢復(fù)，預(yù)后良好，而重度AP病情進展迅速，可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multipleorgan dysfunction syndrome，MODS)，病死率高達30％～50％。目前關(guān)于AP的

2、發(fā)病機制還未完全闡明，近年來隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在AP的發(fā)生發(fā)展中具有不可忽視的作用。
　　AP中胰腺腺泡細胞損傷主要表現(xiàn)為凋亡和壞死。細胞壞死時各種消化酶和炎癥介質(zhì)隨著細胞膜的破壞而釋放，從而導(dǎo)致劇烈的炎癥反應(yīng);而凋亡是程序性細胞死亡，由于細胞膜保持完整，從而減少炎癥介質(zhì)的釋放，避免炎癥反應(yīng)進一步加重。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinylaspartate specific proteinase，caspa

3、se)家族是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵分子，其中Caspase-3是凋亡執(zhí)行因子之一。目前已證實，上調(diào)Caspase-3表達可通過促進腺泡細胞凋亡而起到保護性作用。
　　Hedgehog(Hh)信號通路在多種動物的胚胎發(fā)育、組織再生、干細胞增殖等過程中具有重要作用。研究表明，Hh信號通路不僅與胚胎發(fā)育有關(guān)，而且與炎癥反應(yīng)及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究者發(fā)現(xiàn)在AP病程中，Hh信號通路具有減輕炎癥反應(yīng)、保護胰腺組織的作用，但是其具體機

4、制尚未明確，特別是Hh信號通路是否可以通過調(diào)控胰腺腺泡細胞凋亡影響AP的病程進展，目前未見報道。
　　目的:本實驗采用L-精氨酸腹腔注射建立AP大鼠模型，并予Hh信號通路特異性激動劑Purmorphamine進行干預(yù)，探究Hh信號通路在AP中對胰腺腺泡細胞凋亡的影響。
　　方法:清潔級成年健康雄性SD大鼠54只，體重220±20 g，隨機分為正常對照組（N組）、急性胰腺炎組（AP組）、Purmorphamine干預(yù)組（Pur

5、組），每組各18只。各組依據(jù)造模時間分為6h、12h、24h三個亞組，每個亞組6只大鼠。本實驗采用腹腔注射20％L-精氨酸的方法建立AP模型，劑量為2.5 g/kg×2次，間隔1h。其中Pur組于造模前1h給予Purmorphamine溶液0.69 mg/kg腹腔注射1次。在最后一次腹腔注射后6h、12h、24h，分別處死各組大鼠，觀察胰腺及胰周組織情況，留取胰腺組織標(biāo)本，通過蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色

6、觀察胰腺組織病理學(xué)改變，采用蛋白印跡(western blot)法檢測胰腺組織Caspase-3表達水平，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，Real-timePCR)法檢測Hh信號通路下游目的基因Ptch1表達水平，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediateddUTP nick end

7、 labeling，TUNEL)法檢測胰腺腺泡細胞凋亡水平。
　　結(jié)果:
　　1、胰腺肉眼觀察:N組胰腺顏色均勻，周圍組織未見明顯異常，腹腔內(nèi)僅有極少量清亮液體;AP組可見胰腺充血水腫、胃腸道積氣及血性腹水;Pur組大鼠在各時間點與AP組相比，胰腺充血水腫減輕，胃腸道積氣及腹水量較前明顯減少。鏡下觀察:N組胰腺組織在各時間點均未發(fā)現(xiàn)明顯異常;AP組胰腺組織可見小葉和腺泡間水腫、炎癥細胞浸潤及腺泡細胞壞死，并且隨著時間的推移逐

8、漸加重;Pur組標(biāo)本在各時間點與A組相比水腫明顯減輕，炎癥細胞浸潤及壞死明顯減少。
　　2、胰腺腺泡細胞凋亡水平:N組胰腺組織僅有少量陽性細胞零星分布;AP組各時間點陽性細胞較N組明顯增加、凋亡指數(shù)升高(P＜0.05），并且隨著造模時間延長而逐漸降低;與AP組相比，Pur組胰腺組織凋亡指數(shù)進一步升高（P＜0.05），變化趨勢與AP組相同。
　　3、胰腺組織Caspase-3表達:N組可見Caspase-3少量表達;與之相比，

9、AP組Caspase-3表達增加(P＜0.05），但隨時間推移逐漸下降;經(jīng)Purmorphamine預(yù)處理后，Pur組Caspase-3表達水平較AP組明顯提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　4、胰腺組織Ptch1 mRNA表達:N組Ptch1未見明顯表達;而AP組與N組相比，各時間點Ptch1表達水平均明顯升高（P＜0.05），且隨時間呈上升趨勢;Pur組由于Purmorphamine的作用，Ptch1表達水平較AP

10、組進一步升高(P＜0.05)。
　　5、相關(guān)性分析:胰腺組織凋亡指數(shù)與Caspase-3表達水平之間呈正相關(guān)（rs=0.911，P＜0.01）。胰腺組織Ptch1表達水平與凋亡指數(shù)、Caspase-3之間分別存在正相關(guān)（rs=0.713，P＜0.01;rs=0.648，P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1、正常對照組大鼠胰腺組織僅有少量凋亡細胞分布，而在AP組早期，凋亡細胞明顯增加、凋亡指數(shù)升高，之后隨著造模時間延長而

11、逐漸下降，同時胰腺病理損傷逐漸加重，說明腺泡細胞凋亡可能在一定程度上抑制AP病情進展。
　　2、Caspase-3作為凋亡執(zhí)行因子之一，在AP組各時間點的表達均明顯增加，并且隨時間推移逐漸下降，其表達水平與細胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)。
　　3、作為Hh信號通路的重要組成部分和主要目的基因之一，Ptch1在AP組大鼠胰腺組織中的表達較正常對照組明顯增加;應(yīng)用Hh信號通路特異性激動劑Purmorphamine后，Ptch1的表達較AP