2.12017《微生物的實驗室培養(yǎng)》

1、19世紀(jì)中期，關(guān)系到法國經(jīng)濟命脈的釀造業(yè)曾一度遭受毀滅性的打擊。在生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)了葡萄酒變酸、變味的怪事。經(jīng)過一番研究，法國科學(xué)家巴斯德發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致生產(chǎn)失敗的根源在于發(fā)酵物中混入了雜菌。由此人們認(rèn)識到保持培養(yǎng)純凈的重要性。 防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物，是研究和應(yīng)用微生物的前提。在實驗室培養(yǎng)微生物，一方面需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，另一方面需要確保無處不在的其他微生物無法混入。,新課引入,課題1 微生物的實驗室

2、培養(yǎng),專題2 :微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,【學(xué)習(xí)目標(biāo)】,了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸汽滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。,一、微生物,1.概念：形體微小，結(jié)構(gòu)簡單，通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看清的低等微小生物。,2. 范圍：,,病 毒,原核生物（如細(xì)菌、放線菌）,真 菌（如霉菌、酵母菌）,原生生物（變形蟲）,3. 特征 ?。▊€體微小） 簡（結(jié)構(gòu)簡單）低（進(jìn)化

3、地位低）,4.與人類的關(guān)系,5. 示例,芽孢,有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。 芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌.,菌落：,單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌

4、落是鑒定菌種的重要依據(jù)。,菌落,細(xì)菌的菌落特征因種而異,二、培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。,（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等。液體培養(yǎng)基常用于工業(yè)發(fā)酵。（2）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。,1、培養(yǎng)基的類型和用途,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基:

5、 分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物,伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因為其代謝產(chǎn)物與伊紅—美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落顯示出來。這個過程并沒有促進(jìn)大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。,鑒別培養(yǎng)基,根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的

6、種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。,合成培養(yǎng)基:,天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限;成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;,天然培養(yǎng)

7、基：,2、不管哪種培養(yǎng)基，一般都含水、 、和 、 等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對 、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及 的要求。,碳源,氮源,無機鹽,pH,氧氣,？回憶有關(guān)活細(xì)胞中元素組成的知識，想一想為什么大多數(shù)培養(yǎng)基都含有這四類物質(zhì)？,微生物細(xì)胞的化學(xué)組成與其他生物的大體相同，也是由C、H、O、N、P

8、、S以及其他元素組成，其中C、H、O、N占細(xì)胞干重的90%以上，這些元素最終來自外界環(huán)境中的各種有機和無機化合物。,舉例：1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成,碳源、氮源、磷酸鹽和維生素,碳源、氮源和維生素,無機鹽,氫元素、氧元素,3、不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方 (參考教材P83-84頁附錄3內(nèi)容),三、無菌技術(shù),1.無菌技術(shù)的概念,無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學(xué)到的倒平板、

9、平板劃線法操作，還是稀釋涂布平板法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。,列表比較消毒和滅菌區(qū)別：,,較溫和的物理或化學(xué)方法,強烈的物理或化學(xué)方法,物體表面或內(nèi)部的 部分微生物,所有微生物， 包括芽孢和孢子,①煮沸消毒法：碗、筷等②巴氏消毒法：牛奶③紫外線消毒法：接種室、接種箱、超凈工作臺④化學(xué)藥劑消毒法：手、水源,①灼燒滅菌：接種環(huán)、接種針或

10、其他金屬工具，試管口或瓶口②干熱滅菌：耐高溫、需要保持干燥的玻璃器皿和金屬工具等③高壓蒸汽滅菌：培養(yǎng)基,2. 消毒與滅菌,最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，

11、而空氣中的其他微生物不能通過。,1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管（3） 實驗操作者的雙手,答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,旁欄思考,四、實驗操作,（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,計算,

12、,,稱量,,,溶化,,,滅菌,,,倒平板,,1. 溶化時為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?,可保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中，減少誤差。,2. 加瓊脂的目的是什么?,作為凝固劑,3.在滅菌前, 用牛皮紙、舊報紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的 目的是什么？,在滅菌時能避免水蒸汽凝結(jié)時浸濕棉塞，在取出培養(yǎng)基、 錐形瓶時也起到隔絕空氣中雜菌污染的作用。,4. 培養(yǎng)皿能否用高壓蒸汽滅菌？,不能，因為培養(yǎng)皿要保持干燥，應(yīng)該用干熱滅菌。

13、,倒平板技術(shù),1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？,問題討論,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什

14、么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。,（二）純化大腸桿菌,接種方法有：,平板劃線法: 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細(xì)

15、胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.,平板劃線法和稀釋涂布平板法,平板劃線法,問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物； 每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃

16、線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。 劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁

17、殖而來的菌落。,稀釋涂布平板法,（2）稀釋涂布平板時的注意事項：,①稀釋操作中的每支試管及其中的9mL水、移液管均需滅菌②涂布器末端要浸在70%的酒精中。取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。③操作中一定要防火！不要將過熱的涂布器放在盛酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。④涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。⑤應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任

18、何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,,微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),菌種的保存,1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。 2、長期保存：甘油管藏法,五、課題成果評價,（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌

19、菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。,本課題知識小結(jié):,【思維激活1】用酒精擦拭實驗者手臂屬消毒還是滅菌？70%與95%的酒精，哪一種

20、效果更好？為什么？,酒精擦拭屬化學(xué)消毒，酒精消毒時，70%的酒精殺菌效果最好。原因是：濃度過高，使菌體表面蛋白質(zhì)凝固成一層保護(hù)膜，乙醇分子不能滲入其中；濃度過低，殺菌力減弱。,【思維激活2】微生物接種技術(shù)中最核心的內(nèi)容是什么？,防止雜菌污染，保證培養(yǎng)物的純度。,【例1】（1）瓊脂 （2）先調(diào)PH，后滅菌（3）通用 選擇 硝酸銨 （4）芽孢（5）20mg/l氯苯 碳源最早耗盡,隨堂達(dá)標(biāo)檢測：4、（

21、1）氮源 牛肉膏和蛋白胨 滅菌（2）平板劃線法 稀釋涂布平板法（3）稀釋倍數(shù)不夠，菌液的濃度太高；劃線時，劃完第一次沒有滅菌即接著劃第二次；培養(yǎng)過程滅菌不嚴(yán)格，受到微生物的污染。,【例3】（1）檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格 3.8X107 （2）灼燒 將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得單個菌落 （3）B（4）溶解氧 營養(yǎng)物質(zhì),移液管的使用方法,移取液體時，把移液管的尖端伸入液體中，右手拇指