臨床微生物實(shí)驗(yàn)室

1、臨床微生物實(shí)驗(yàn)室 血培養(yǎng)操作規(guī)范,劉 英 2015-6-11,血液及無(wú)菌體液 —— 最有意義的病原學(xué)檢測(cè)標(biāo)本,根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果：選擇正確的抗感染治療方案 調(diào)整經(jīng)驗(yàn)治療方案 判斷感染性疾病的類(lèi)型評(píng)價(jià)療效及預(yù)后正確采取感染控制措施是否隔離減少院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)敏感事件 （如：生物恐怖）,完整的血培養(yǎng)過(guò)程,醫(yī)師開(kāi)出醫(yī)囑護(hù)理人員收集送檢樣本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、分離并鑒定導(dǎo)致血流

2、感染的微生物三級(jí)報(bào)告：為臨床醫(yī)生提供抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果,我院：10年統(tǒng)計(jì)新生兒20% 13- 14年6-8%,國(guó)內(nèi)血培養(yǎng)現(xiàn)狀 —陽(yáng)性檢出率低?10% （國(guó)外約為15％）,原因何在？,血流中含菌量低血液中抗菌物質(zhì)抗生素的應(yīng)用培養(yǎng)條件限制,血培養(yǎng)的臨床 實(shí)踐欠規(guī)范??！,一、采血指征,可疑感染患

3、者出現(xiàn)以下一種或幾種特征時(shí)，可以考慮采集血培養(yǎng)：a) 發(fā)熱（ ≥38℃）或低溫（ ≤36℃）；b) 寒戰(zhàn)；c) 白細(xì)胞計(jì)數(shù)增多（計(jì)數(shù)>10.0×109/ L，特別有“ 核左移” 時(shí)） 或減少（ 計(jì)數(shù)<3.0×109/ L）；d) 皮膚黏膜出血；e) 昏迷；f) 多器官衰竭；g) 血壓降低；h) C 反應(yīng)蛋白升高；i) 降鈣素原（ PCT）升高；j) 1,3-β -D-葡聚糖（ G 試驗(yàn)

4、）升高；k) 突然發(fā)生的急性呼吸、體溫和生命體征改變。,采血時(shí)間 宜在寒戰(zhàn)或高熱高峰前后采集，用抗菌藥物之前采集。,0,30,60,時(shí)間 (分鐘),體溫,血培養(yǎng)采血時(shí)機(jī),,,,細(xì)菌濃度,,血培養(yǎng)套數(shù),應(yīng)同時(shí)采集 2～3 套血培養(yǎng)， 2d～5 d 內(nèi)無(wú)需重復(fù)采集血培養(yǎng)。只有在懷疑感染性心內(nèi)膜炎或其它血管內(nèi)感染（如導(dǎo)管相關(guān)性感染）時(shí)，才有必要間隔多次采集血培養(yǎng)。 對(duì)于新生兒，采集一瓶?jī)和柩跗?，宜同時(shí)做尿液和

5、腦脊液培養(yǎng)。,采血量 成人每瓶采血量 8 mL～10 mL，兒童 1mL～5 mL，但不應(yīng)超過(guò)患兒總血量的 1%。血液和肉湯之比為 1： 5～1： 10。 新生兒 0.5mL。 采血量充足的患者宜配套采集需氧瓶和厭氧瓶， 將血液先注入?yún)捬跗浚笞⑷胄柩跗?。采血量不足的患者?yīng)將足量血標(biāo)本先注入需氧瓶，再將剩余血液注入?yún)捬跗俊?有利于分離出真菌、銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌。血培養(yǎng)瓶運(yùn)送

6、血培養(yǎng)瓶應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室孵育或上機(jī)，如果運(yùn)送延遲，應(yīng)在血液接種以后盡快 35℃～37℃孵育，切勿冷藏或冷凍。如果病房沒(méi)有孵箱，血培養(yǎng)瓶應(yīng)置于室溫下，而非冷藏或冷凍。,7 血培養(yǎng)安全防護(hù),7.1 實(shí)驗(yàn)室獲得感染途徑 針刺傷病毒感染，包括乙肝病毒、 丙肝病毒和 HIV； 皮膚粘膜暴露是肝炎病 毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的主要途徑，而其它的主要途徑是氣溶膠或微滴。 7.2 防護(hù)措施7.2.1 洗手

7、洗手是預(yù)防實(shí)驗(yàn)室獲得感染的關(guān)鍵要素。在戴手套前、摘手套后、工作結(jié)束后、 離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室和進(jìn)入清潔區(qū)時(shí)，都必須洗手。 如直接接觸血液或任何潛在的感染性物質(zhì)后必須立即清洗暴露部位。7.2.2 防護(hù)屏障1.采集血培養(yǎng)時(shí)應(yīng)戴手套，采集下一患者時(shí)須換手套。血液污染手套、有破損跡象或失去防護(hù)作用時(shí)，必須及時(shí)更換。在接收和處理標(biāo)本時(shí)， 需要戴手套。2.可能發(fā)生血液或其它感染性物質(zhì)噴濺的情況下， 需要面部防護(hù)。3.在沒(méi)有安全柜的情況下， 血

8、培養(yǎng)操作和檢驗(yàn)時(shí)需要穿防水、長(zhǎng)袖、前面封閉的隔離服。存在任何可見(jiàn)污染時(shí)立即脫去。污染的隔離服必須作為生物危險(xiǎn)垃圾丟棄或嚴(yán)格按流程清洗。離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室或去實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的清潔區(qū)時(shí)要脫去隔離服。 4.在處理陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶時(shí)， 必須在Ⅱ級(jí)生物安全柜中進(jìn)行。,7.2.5 標(biāo)準(zhǔn)防范措施,所有實(shí)驗(yàn)室員工應(yīng)接受基本原理及標(biāo)準(zhǔn)防護(hù)措施的操作培訓(xùn)。相關(guān)的安全防護(hù)措施包括以下內(nèi)容：a) 盡可能減少注射器及銳器的使用；b) 必須使用注射器時(shí)， 應(yīng)避免回套

9、針帽；c) 若用注射器采集血液， 將血液直接注入血培養(yǎng)瓶， 無(wú)需更換針頭。 注射器使用完畢后， 應(yīng)將針頭放入銳器桶，不可重復(fù)使用；d) 使用后的注射器或其他銳器如需轉(zhuǎn)運(yùn)， 必須裝入銳器桶內(nèi)。7.2.6 實(shí)驗(yàn)室意外事故控制在污染區(qū)域采取能使實(shí)驗(yàn)室人員暴露風(fēng)險(xiǎn)最小化的控制程序。 禁止在污染區(qū)用嘴吹吸移液管、 咬指甲、 抽煙、飲食、 摘戴隱形眼鏡 、手或其他環(huán)境表面與眼、鼻、嘴接觸等?？赡馨l(fā)生溢灑噴濺的操作， 必須在生物安全柜

10、中進(jìn)行。離心機(jī)宜使用帶有生物安全罩的轉(zhuǎn)子或離心桶。盡可能采用螺口密封的塑料離心管， 使用前仔細(xì)檢查塑料離心管有無(wú)損壞的跡象。因樣本中可能含有經(jīng)空氣傳播的病原體， 轉(zhuǎn)子或離心桶及離心的樣本應(yīng)在生物安全柜中打開(kāi)。在打開(kāi)轉(zhuǎn)子或離心桶前， 檢查內(nèi)部離心管有無(wú)損壞。,7.3.3 標(biāo)本處理 所有標(biāo)本必須在生物安全 II 級(jí)防護(hù)下處理。疑為高致病性病原體如結(jié)核分枝桿菌、布魯菌屬、 弗朗西斯菌屬、鼠疫耶爾森菌、類(lèi)鼻疽博克霍爾德菌陽(yáng)性的血培養(yǎng)

11、瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，處理操作需按生物安全 III 級(jí)防護(hù)進(jìn)行。 疑為腦膜炎奈瑟菌的菌株必須在生物安全柜中處理。,8 血培養(yǎng)結(jié)果的處理及報(bào)告程序,8.1 血培養(yǎng)陽(yáng)性處理及三級(jí)報(bào)告程序一級(jí)報(bào)告（初步報(bào)告） 對(duì)于陽(yáng)性血培養(yǎng)， 要立即進(jìn)行涂片和革蘭染色，并報(bào)告給臨床醫(yī)師，包括：患者姓名、陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶類(lèi)型、瓶數(shù)、報(bào)警時(shí)間、涂片革蘭染色特性及形態(tài)，詢(xún)問(wèn)患者目前感染情況和抗菌藥物使用情況并記錄，可以向醫(yī)師提出治療建議。此外，還應(yīng)記錄報(bào)

12、告時(shí)間、接收?qǐng)?bào)告者信息和報(bào)告者信息。同時(shí)將陽(yáng)性培養(yǎng)液傳種適當(dāng)培養(yǎng)基。 各單位可以根據(jù)自身醫(yī)療需求，決定是否基于涂片結(jié)果用培養(yǎng)液進(jìn)行直接藥敏試驗(yàn)。,二級(jí)報(bào)告（補(bǔ)充報(bào)告）,第二天將初步鑒定結(jié)果回報(bào)醫(yī)師。如進(jìn)行直接藥敏試驗(yàn)，應(yīng)回報(bào)藥敏結(jié)果。,三級(jí)報(bào)告（終報(bào)告）,包括菌種名稱(chēng)、血培養(yǎng)陽(yáng)性時(shí)間（以小時(shí)計(jì)算）和標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果。,,報(bào)告內(nèi)容：血培養(yǎng)經(jīng) XX 天培養(yǎng)陰性，自動(dòng)化儀器細(xì)菌培養(yǎng)一般設(shè)定周期為 5d、真菌 14d、分枝桿菌 42d

13、；手工法細(xì)菌培養(yǎng)一般周期設(shè)定為 7d、真菌 14d、分枝桿菌 60d。 可以在 72h 培養(yǎng)陰性后，進(jìn)行初步報(bào)告，但應(yīng)說(shuō)明“培養(yǎng) 3d 陰性，標(biāo)本將延長(zhǎng)培養(yǎng)至 XX 天，如為陰性不重復(fù)報(bào)告”。如果 72h 后陽(yáng)性，應(yīng)按血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)告程序處理，與臨床溝通并補(bǔ)發(fā)陽(yáng)性報(bào)告。,8.2 血培養(yǎng)陰性報(bào)告程序,血培養(yǎng)質(zhì)量控制,9.1 檢驗(yàn)前質(zhì)控患者評(píng)估血培養(yǎng)申請(qǐng)標(biāo)本采集實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期對(duì)血培養(yǎng)污染率進(jìn)行評(píng)估，污染瓶數(shù)應(yīng)控制在 5%

14、以下。如超過(guò)此標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)與臨床進(jìn)行溝通， 并采取相應(yīng)控制改進(jìn)措施。標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)本接收和處理以下情況的血培養(yǎng)標(biāo)本， 可以接收但是需要告知醫(yī)師：a) 采血量不足；b) 血培養(yǎng)套數(shù)或瓶數(shù)不夠；c) 僅接種需氧或厭氧瓶。,9.2 檢測(cè)中質(zhì)控,培養(yǎng)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證， 自制培養(yǎng)瓶的室內(nèi)質(zhì)控， 革蘭染色、 鑒定試劑、 儀器、培養(yǎng)基質(zhì)控和藥敏試驗(yàn)質(zhì)控， 結(jié)果審核和報(bào)告解釋。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)每個(gè)項(xiàng)目的質(zhì)量控制， 制訂詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（ SOP

15、）。,9.3 檢測(cè)后質(zhì)控,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)涂片口頭報(bào)告。應(yīng)建立初步藥敏報(bào)告和最終報(bào)告的審核制度，并進(jìn)行定期匯總分析， 對(duì)實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（ LIS）需進(jìn)行傳輸和性能驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)以上項(xiàng)目制訂 SOP。,14 血培養(yǎng)污染,即便進(jìn)行嚴(yán)格的皮膚消毒以及在接種、傳代中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，仍有 3%～5%的血培養(yǎng)結(jié)果來(lái)自皮膚（如表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌、梭菌、類(lèi)白喉棒狀桿菌）或周?chē)h(huán)境（如不動(dòng)桿菌屬、芽胞桿菌屬）的污染菌株。然而，這些微生物有

16、時(shí)也會(huì)成為致病菌甚至可導(dǎo)致心內(nèi)膜炎。在下列情況可能是致病菌：a) 不同部位血液標(biāo)本的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)出同一種微生物；b) 生長(zhǎng)迅速、 48h 內(nèi)；c) 多次分離出具有同樣生物學(xué)特性和相同藥敏結(jié)果的菌株。所有的結(jié)果都應(yīng)向臨床醫(yī)生報(bào)告，包括可能的污染菌，但不做藥敏試驗(yàn)，在報(bào)告單上應(yīng)有恰當(dāng)?shù)奶崾?，如痤瘡丙酸桿菌（皮膚共生菌）。血培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)兩種或兩種以上細(xì)菌生長(zhǎng)，可能是復(fù)數(shù)菌菌血癥，常見(jiàn)于衰弱的患者，也可能是污染所致。發(fā)生厭氧菌菌血癥時(shí)

17、可能有多種病原菌感染，如腸道的嚴(yán)重創(chuàng)傷或手術(shù)，可發(fā)生嚴(yán)重的暴發(fā)性菌血癥，此時(shí)可有一種或多種厭氧菌與一種或多種需氧菌在血中同時(shí)存在。,2.4 血培養(yǎng)污染率,一般由凝固酶陰性葡萄球菌、革蘭陽(yáng)性棒狀桿菌、 芽孢桿菌、痤瘡丙酸桿菌和微球菌等污染引起的陽(yáng)性瓶占總送檢瓶數(shù)的比例。,血培養(yǎng)的污染分析,理想的消毒條件下，仍有3%?5%污染菌不可能5% 不能確定30% 可能70%,金葡菌肺炎鏈球菌

18、腸桿菌科菌綠膿桿菌白色念珠菌,棒狀桿菌.非炭疽革蘭陽(yáng)性桿菌痤瘡丙酸桿菌,凝固酶陰性葡萄球菌,,Source: Kim SD, et al: Infect Control Hosp Epidemiol 2000;21:213-7,,,預(yù)測(cè)其可能性病人危險(xiǎn)因子prosthetic 裝置臨床證據(jù),試驗(yàn)后的分析#陽(yáng)性 / # 培養(yǎng)物 比較抗菌譜 比較基因型,,,血培養(yǎng)假陽(yáng)性的原因分析（1）,血液中的白細(xì)胞數(shù)過(guò)高：分析其原

19、因可能是標(biāo)本中全血白細(xì)胞過(guò)高可釋放一定量的CO2使pH改變導(dǎo)致假陽(yáng)性．可能與抽血量>12 ml，從而導(dǎo)致瓶?jī)?nèi)過(guò)多的白細(xì)胞富集；,血培養(yǎng)假陽(yáng)性的原因分析（2）,溫度不穩(wěn)定引起假陽(yáng)性，由于停電所致，說(shuō)明停電是引起假陽(yáng)性的原因之一也可能培養(yǎng)基從冰箱中取出立即抽血,假陰性的原因分析（2）,也可能與抽血后培養(yǎng)瓶放入儀器前置室溫或普通孵箱中過(guò)久有關(guān)?？琉B(yǎng)菌感染：包括鏈球菌和流感嗜血桿菌等，此類(lèi)細(xì)菌在培養(yǎng)過(guò)程中，生長(zhǎng)緩慢，代謝能力極