hbv、hcv高精度核酸檢測(cè)技術(shù)的臨床意義

1、肝炎病毒PCR檢測(cè)技術(shù)國(guó)內(nèi)現(xiàn)狀及最新進(jìn)展 暨HBV/HCV高精度核酸檢測(cè)技術(shù)的臨床意義,主要內(nèi)容,Part Ⅰ 熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介Part Ⅱ HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展Part Ⅲ 臨床對(duì)HBV/HCV檢測(cè)技術(shù)的需求Part Ⅳ HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,Part Ⅰ PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,病原學(xué)檢測(cè)常用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù) ☆ 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

2、（“金標(biāo)準(zhǔn)”）、動(dòng)物實(shí)驗(yàn) ☆ 血清學(xué)、免疫學(xué)診斷技術(shù) ☆ 電鏡技術(shù) ☆ 分子生物學(xué)診斷技術(shù)——PCR,PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：Polymerase Chain Reaction),Polymerase: DNA聚合酶,PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,核裂變鏈?zhǔn)椒磻?yīng),“鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”改變世界,,,PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,PCR技術(shù)的誕生,Kary B. Mullis（穆利斯（美））,1971：Khorana等提出在

3、體外經(jīng)DNA變性、引物 雜交,再用DNA聚合酶延伸DNA的設(shè)想。1983：Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。1988：耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù) 1993：Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,Kary B. Mullis（1944－）,http://www.karymullis.com,The New York Times as "hi

4、ghly original and significant, virtually dividing biology into the two epochs of before P.C.R. and after P.C.R.",PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,PCR原理：實(shí)質(zhì)就是體外基因復(fù)制技術(shù),PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量,10億,PCR技術(shù)分類,常規(guī)PCR 在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行分析。

5、 巢式PCR 多重PCR PCR結(jié)合限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP） PCR結(jié)合特異性寡合苷酸探針斑點(diǎn)雜交（PCR-ASO） PCR結(jié)合變性梯度凝膠（PCR-DGGE） PCR結(jié)合的單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）等分析技術(shù),熒光定量 PCR（real-time PCR) 通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤,實(shí)時(shí)在線

6、監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。 實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量。,PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,熒光定量實(shí)時(shí)PCR與普通PCR的比較實(shí)時(shí)在線監(jiān)控 對(duì)樣品擴(kuò)增的整個(gè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增加,直觀地看到反應(yīng)的對(duì)數(shù)期降低反應(yīng)的非特異性 使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合,提高了PCR反應(yīng)的特異性增加定量的精確性

7、 全程監(jiān)控,準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量結(jié)果分析更加快捷方便,無需跑膠,PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,1、目的基因的克?。?　PCR技術(shù)為在重組DNA過程中獲得目的基因片段提供了簡(jiǎn)便快速的方法。2、基因的體外突變：　　　可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。,PCR的應(yīng)用,3、DNA和RNA的微量分析：　　　PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。實(shí)際工作中，一滴血液、一

8、根毛發(fā)或一個(gè)細(xì)胞已足以滿足PCR的檢測(cè)需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用前景。4、基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)　　　RT-PCR可檢測(cè)不同組織或細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄水平5、基因突變分析：　　　利用PCR與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性。,PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,Part Ⅱ HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,乙型肝炎檢測(cè)標(biāo)志物☆ HBsAg, 抗-HBs,☆ HBeAG,抗-HBe

9、,☆抗-HBc（IgG,IgM）,☆ HBV-DNA,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,☆ 免疫學(xué)檢測(cè) ☆ 生物化學(xué)檢測(cè) ☆ 組織學(xué)檢測(cè) ☆ 分子生物學(xué)檢測(cè) ☆ 基因芯片,乙肝病毒的檢測(cè)方法,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,HBV分子生物學(xué)檢測(cè)☆ HBV-DNA☆ 基因耐藥突變檢測(cè)☆ 基因分型☆ HBVcccDNA☆ HBV前C及核心啟動(dòng)子

10、變異,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,HBV分子生物學(xué)檢測(cè)方法及臨床意義,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,HBV分子生物學(xué)檢測(cè)方法及臨床意義,HCV的感染模型,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,丙肝病毒的檢測(cè)方法,☆ 血清生化學(xué)檢測(cè)☆ HCV抗體檢測(cè)☆ HCV核心抗原檢測(cè)☆ HCV RNA 檢測(cè),HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,HCV分子生物學(xué)檢測(cè)方法及臨床意義,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展

11、,目前國(guó)內(nèi)外乙肝主流基因診斷技術(shù)比較,除個(gè)別公司產(chǎn)品外，國(guó)內(nèi)的檢測(cè)技術(shù)在方法學(xué)、靈敏度以及準(zhǔn)確性方面一般都遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國(guó)家,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,常用DNA類標(biāo)本處理方法,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,常用RNA類標(biāo)本處理方法,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,高靈敏度的磁珠核酸純化方法的比較,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,（圣湘）磁珠法HBV產(chǎn)品與國(guó)內(nèi)外主流產(chǎn)品的比較,,,,,HBV/HCV核酸檢

12、測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,圣湘磁珠法HCV產(chǎn)品與國(guó)內(nèi)外主流產(chǎn)品的比較,25 IU/ml,,,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,不同方法的HBV DNA檢測(cè)下限以及不同標(biāo)準(zhǔn)要求,,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,☆國(guó)內(nèi)大部分檢測(cè)試劑靈敏度≥1000Copies/ml，特異性、準(zhǔn)確性等方 也存在著嚴(yán)重缺陷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床檢測(cè)和用藥監(jiān)控的需求，這也是國(guó)內(nèi)HCV研究進(jìn)展緩慢的重要原因之一。,,HBV/HCV核酸檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及進(jìn)展,Part

13、Ⅲ 臨床對(duì)HBV/HCV檢測(cè)技術(shù)的需求,“2008年美國(guó)肝病協(xié)會(huì)CHB防治指南”：持久消除HBV是乙肝的治療終點(diǎn)，HBV DNA病毒載量盡可能小于或等于10 IU/ ml。,臨床對(duì)HBV/HCV檢測(cè)技術(shù)的需求,“歐洲肝病研究學(xué)會(huì)EASL2010年指南”指出：采用熒光實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)HBV DNA時(shí)，其靈敏度要小于或等于10-15 IU/ ml。,臨床對(duì)HBV/HCV檢測(cè)技術(shù)的需求,“歐洲肝病研究學(xué)會(huì)EASL2011指南”還指出：丙

14、肝患者治療的終點(diǎn)是HCV RNA病毒載量低于50 IU/ ml。,臨床對(duì)HBV/HCV檢測(cè)技術(shù)的需求,研究表明國(guó)產(chǎn)PCR試劑的靈敏度很難達(dá)到上述要求,五種乙型肝炎病毒核酸熒光定量檢測(cè)試劑盒的比較,中華傳染病雜志，2009年 第3期 ——吳星,黃維金, 周誠(chéng) ,莊輝 等(中國(guó)藥品生物制品檢定所,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部),臨床對(duì)HBV/HCV檢測(cè)技術(shù)的需求,國(guó)內(nèi)行業(yè)指導(dǎo)原則,國(guó)家SFDA技術(shù)審評(píng)中心《HBV DNA定量試劑技術(shù)審評(píng)指導(dǎo)原則》

15、中指出： HBV DNA最低檢測(cè)限應(yīng) ≤30IU/ml,臨床對(duì)HBV/HCV檢測(cè)技術(shù)的需求,國(guó)產(chǎn)很多乙肝PCR試劑的靈敏度為500IU/ml至1000IU/ml之間，丙肝試劑的靈敏度為在1000IU/ml以上。從病毒性肝炎的早期診斷及適時(shí)確定治療終點(diǎn)的臨床需求看，現(xiàn)有的國(guó)產(chǎn)PCR試劑需要提高檢測(cè)靈敏度。,國(guó)內(nèi)現(xiàn)狀,臨床對(duì)HBV/HCV檢測(cè)技術(shù)的需求,Part Ⅳ HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,HB

16、V DNA基線水平較高增加肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn),HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,持續(xù)高HBV DNA水平和肝癌發(fā)病增加相關(guān),,,HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,,高HBV DNA水平預(yù)示長(zhǎng)期肝相關(guān)死亡率風(fēng)險(xiǎn),HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,乙肝的治療,慢性乙肝的診斷1. HBsAg持續(xù)陽性6個(gè)月以上2. HBV-DNA高于105拷貝/毫升3. ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高 

17、;慢性乙肝的分類1. HBeAg陽性乙肝：HBsAg、HBeAg陽性； HBV-DNA高于105拷貝/毫升；ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高2. HBeAg陰性乙肝：HBsAg、anti-HBe陽性； HBV-DNA高于104拷貝/毫升；ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高 慢性乙肝治療的目標(biāo)病毒抑制：表現(xiàn)為HBeAg血清轉(zhuǎn)換和HBV-DNA陰轉(zhuǎn)肝損傷程度降低：表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常完全清除病毒：表現(xiàn)為HBsAg消失，HBsAb出現(xiàn)

18、，血清和肝細(xì)胞中檢測(cè)不到HBV-DNA，從目前水平來看，不可能完全清除病毒,HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,臨床檢測(cè)HBV DNA啟動(dòng)抗病毒治療，連續(xù)定量HBV DNA是病人治療前評(píng)估的關(guān)鍵！,HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,ALT：谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ULN：正常值的上限LT：肝移植,慢性乙型肝炎HBeAg陽性病人治療指南（亞太肝病研究會(huì)2008年）,HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,

19、慢性乙型肝炎HBeAg陰性病人治療指南,HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,慢性乙型肝炎肝硬化病人治療指南,ETV：恩替卡韋LAM：拉米夫定Ldt：替比夫定ADV：阿德福韋,HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,上圖為采用羅氏公司Cobas Taqman／Amplicor HBV DNA定量PCR試劑時(shí)治療路線圖,替比夫定治療慢性乙型肝炎中國(guó)路線圖,,,HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,部

20、分HBV DNA定量試劑檢測(cè)性能比較,HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,注：檢出限為100Copies/ml,慢性丙肝治療建議 由亞太地區(qū)肝病學(xué)會(huì)（APASL）、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）、歐洲肝病學(xué)會(huì)（EASL）等發(fā)表的有關(guān)丙型肝炎的診療指南或?qū)＜夜沧R(shí)中指出：目前對(duì)丙肝最有效的治療是聚乙二醇化干擾素α聯(lián)合利巴韋林。,治療應(yīng)答的定義及描述,HBV/HCV高精度檢測(cè)技術(shù)對(duì)肝病診療的臨床意義,HCV RNA基因?yàn)?/p>