手足口病標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案

1、手足口病標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案,2014年版,目錄,病原學(xué),手足口?。╤and, foot and month disease, HFMD）是由腸道病毒引起的急性傳染病，多發(fā)于10歲以下嬰幼兒，以手、足、口腔等部位皮膚黏膜的皮疹、皰疹、潰瘍?yōu)榈湫捅憩F(xiàn)，個(gè)別患者可出現(xiàn)心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦脊髓膜炎、腦炎等并發(fā)癥。手足口病并不是一種新發(fā)傳染病，自1957年首次報(bào)道以來(lái)，曾在許多國(guó)家和地區(qū)多次流行。2006年世界衛(wèi)生組織公布該病在須申報(bào)疾

2、病的發(fā)病率中居第四位。該病全年皆可發(fā)生，我國(guó)以夏秋季多發(fā)，是可防、可治且預(yù)后較好的小兒常見(jiàn)傳染病。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部于2008年5月2日起，將該病列為丙類傳染病管理。,背景知識(shí),,,病原學(xué),引起手足口?。℉FMD）的病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括： 柯薩奇病毒 A組（Coxasckievirus A, CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等 B組（Coxa

3、sckievirus B, CVB)的1、2、3、4、5 型等； 腸道病毒71型（Human Enterovirus 71, EV71）； ?？刹《荆‥chovirus, ECHO）等。,背景知識(shí),,,病原學(xué),其中以EV71和CVA16為主要病原。近年來(lái)我國(guó)陸續(xù)出現(xiàn)這兩種病原引起的HFMD季節(jié)性流行，局部呈強(qiáng)流行態(tài)勢(shì)。由此，HFMD的有關(guān)研究日益受到人們的重視。 目前對(duì)于HFMD

4、感染尚沒(méi)有特效的疫苗和藥物，主要采用對(duì)癥和支持治療，積極防止發(fā)生并發(fā)癥，因此加強(qiáng)疾病及病原的監(jiān)測(cè)、準(zhǔn)確處置疫情、開(kāi)展健康教育是控制的關(guān)鍵。,背景知識(shí),,,國(guó)外流行概況,手足口病是一種全球性傳染病，世界大部分國(guó)家和地區(qū)均有此病流行的報(bào)道。 1957年首先發(fā)生于加拿大，并于同年在新西蘭被最早加以描述和報(bào)告。 1958年加拿大初步查出CVA16病毒為本病病原。澳大利亞、美國(guó)、瑞典是最早出現(xiàn)手足口病的國(guó)家之一。

5、 1959年英國(guó)伯明翰、美國(guó)加利福尼亞地區(qū)發(fā)生流行，并從患者皰疹液中分離出CVA16，并根據(jù)本病病變分布特點(diǎn)，被正式命名為“手足口病” 。,,,國(guó)外流行概況,1972年EV71病毒引起的手足口病在美國(guó)被首次確認(rèn)，此后EV71感染與CVA16感染交替出現(xiàn)，成為手足口病的主要病原體。 日本是手足口病發(fā)病較多的國(guó)家，歷史上發(fā)生過(guò)多次CVA16，EV71引起的大規(guī)模流行。,,,我國(guó)流行概況,1981年我國(guó)首次在上海市

6、暴發(fā)手足口病。此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、青海、廣東和河南等省市陸續(xù)出現(xiàn)該病報(bào)道。 1983年天津發(fā)生由CVA16引起的手足口病暴發(fā)流行，5~10月間發(fā)生病例7000余例，經(jīng)過(guò)兩年散發(fā)流行后，1986年出現(xiàn)了以托兒所及幼兒園為主的疫情暴發(fā)。 1995年武漢病毒研究所從手足口患兒標(biāo)本中分離到EV71。 1998年深圳市防疫站同樣分離到EV71。,,,我國(guó)流行概況,1998

7、年我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)發(fā)生EV71感染引起的手足口病和皰疹性咽峽炎流行，檢測(cè)哨點(diǎn)共報(bào)告129106例患者，重癥患者405例，死亡78例，多為五歲以下幼兒。 2000年山東省招遠(yuǎn)市手足口病暴發(fā)，市人民醫(yī)院共接診患兒1698例，最小年齡5個(gè)月，最大14歲，3例合并心肌炎死亡。 2008年安徽阜陽(yáng)市發(fā)生較大規(guī)模手足口病疫情，共報(bào)告病例6606例，其中23例死亡 。,,,一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸,,,,,,

8、,（一）糞便標(biāo)本,采集病人發(fā)病3日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。糞便標(biāo)本采集量5-8g/份，采集后立即放入無(wú)菌采便管內(nèi)，外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽， 4℃暫存12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室； -20℃以下低溫冷凍保藏； 長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于-70℃冰箱。,,,一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸,（二）咽拭子標(biāo)本,采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃

9、體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。 4℃暫存并在12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室， -20℃以下低溫冷凍保藏， 需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于-70℃冰箱。,,,一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸,（三）血清標(biāo)本,在手足口病流行年份中應(yīng)采

10、集EV71 和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發(fā)病0-7d）和恢復(fù)期（發(fā)病14-30d）雙份配對(duì)血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)價(jià)血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無(wú)菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。將血清置于-20℃以下冰箱中冷凍保存。,,,一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸,（

11、四）皰疹液,在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標(biāo)本。先用75%的酒精對(duì)皰疹周圍的皮膚進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。所采集標(biāo)本4℃暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，

12、需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。,,,一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸,（五）肛拭子標(biāo)本,采集病人發(fā)病3日內(nèi)的肛拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出后,迅速將棉簽放入裝有3－5ml保存液（含5%牛血清細(xì)胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。采樣管外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。,,,一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸,（六）尸檢標(biāo)本,采

13、集腦、肺和腸淋巴結(jié)等重要組織標(biāo)本，每一采集部位分別使用單獨(dú)的消毒器械。每種組織應(yīng)多部位取材，每部位應(yīng)取2-3份約5-10g的組織，淋巴結(jié)2個(gè)，分別置于15ml-50ml無(wú)菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。,,,一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸,（七）腦脊液標(biāo)本,出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，可采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病毒分離或核酸檢測(cè)。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.0-2.0ml。采集后立即裝入無(wú)菌帶

14、墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。但EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，很難在腦脊液中檢測(cè)到EV71病原。,,,一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸,一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸,臨床標(biāo)本在運(yùn)輸和貯存過(guò)程中要避免反復(fù)凍融。標(biāo)本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運(yùn)輸，12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。依照《人間傳染的病原微生物名錄》，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標(biāo)本按B類包裝，置于冷藏保存盒內(nèi)運(yùn)

15、輸，盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間?？刹捎藐懧坊蚝娇盏榷喾N運(yùn)輸方式，但在運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)采取保護(hù)措施，避免強(qiáng)烈震動(dòng)、重力擠壓等現(xiàn)象。在送到省、地、市級(jí)CDC實(shí)驗(yàn)室時(shí)，包裝盒內(nèi)應(yīng)帶冰且包裝完整。在上送標(biāo)本的同時(shí)，需附帶相關(guān)的《手足口病病例臨床標(biāo)本采樣登記表》。,,,,,,,二、標(biāo)本采集注意事項(xiàng),,,,,在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離到病毒即可診斷該病毒為病因。,,,標(biāo)本保存液的配置,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,,,,,,,（一）病毒分離,

16、,,,,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,1.試劑配置（1）細(xì)胞的生長(zhǎng)液、維持液的配制見(jiàn)下表：,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,（2）糞便標(biāo)本和肛拭子的處理液 完全PBS液中加入P.S溶液，終濃度為青霉素100單位/ml，鏈霉素為100μg/ ml。 完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即為完全PBS工作液。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,用600～80

17、0ml蒸餾水溶解以上鹽類，加蒸餾水補(bǔ)至1000ml，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液（不含鈣、鎂離子）。,A液：,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,B液：,溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。,C液：,溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,2．病毒分離細(xì)胞系 許多細(xì)胞系可支持人腸道

18、病毒（如EV71、CVA16）生長(zhǎng)。 對(duì)于檢測(cè)手足口病的病原來(lái)說(shuō)，建議所有懷疑含EV71、CVA16等腸道病毒感染的標(biāo)本均需接種到以下兩種細(xì)胞系：? RD細(xì)胞，來(lái)源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。? HEp-2細(xì)胞，來(lái)源于人喉癌上皮細(xì)胞。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,3．標(biāo)本的處理（1）糞便標(biāo)本和肛拭子的處理操作步驟： 1）在離心管上標(biāo)記標(biāo)本號(hào)； 2）每管中加入10ml

19、 PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿； 3）在生物安全柜中將每一份糞便標(biāo)本取大約2g加入標(biāo)記好的離心管中（確保離心管上的標(biāo)號(hào)與原始標(biāo)本的標(biāo)號(hào)一致）；肛拭子為2ml； 4）剩余的原始標(biāo)本最好留在原容器中，凍存于－20℃；,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,5）確保擰緊離心管，用機(jī)械震蕩器劇烈震蕩20min； 6）在確保離心機(jī)的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機(jī)在1500g條件下離心20min；

20、 7）在生物安全柜中將每1份標(biāo)本的上清液分別吸入2個(gè)有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應(yīng)再用氯仿處理1次）； 8） 1管糞便懸液凍存于－20℃作為備份，另1管存于4-8℃以備接種。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,（2）皰疹液標(biāo)本的處理 皰疹液標(biāo)本通常直接用于RNA提取或病毒分離。（3）腦脊液標(biāo)本的處理 腦脊液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標(biāo)本的處理

21、 咽拭子要在標(biāo)本運(yùn)輸（保存）液中充分?jǐn)噭?dòng)（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，用于病毒分離時(shí)，需要凍融一次（防止多次凍融），使細(xì)胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細(xì)胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，須用濾器過(guò)濾除菌。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,4．接種和觀察（病毒分離） （1）通常使用８ml的斜面試管培養(yǎng)細(xì)胞，傳細(xì)胞時(shí)，每管加細(xì)

22、胞培養(yǎng)液1.5ml。顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，以確保細(xì)胞是健康、無(wú)污染的。一個(gè)健康的單層細(xì)胞會(huì)在傳代后48小時(shí)左右形成； （2）倒掉生長(zhǎng)液（GM），換上1-1.2ml的維持液（MM）； （3）每一份標(biāo)本需要同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞，正確標(biāo)記每支細(xì)胞培養(yǎng)管（包括標(biāo)本的編號(hào)、日期、傳代數(shù)）； （4）每一種細(xì)胞至少標(biāo)記一管作為陰性對(duì)照；,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,（5）每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫

23、度要求36℃。 （或者使用吸附的方法接種病毒：接種標(biāo)本前，倒掉生長(zhǎng)液（GM），每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度為36℃；吸附1小時(shí)后，換上1.5ml的維持液（MM）。同樣每份標(biāo)本需同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞）。（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)（如細(xì)胞變圓，折光增強(qiáng)并脫離管壁等）；,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,（7）記錄接種管和

24、對(duì)照管細(xì)胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+—4+）、提示細(xì)胞受毒性反應(yīng)、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+，<25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；（8）如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)，要如實(shí)記錄，并觀察直到75%的細(xì)胞發(fā)生變化（3+ CPE），然后儲(chǔ)藏在－20℃以備二次傳代；（9）第一代培養(yǎng)見(jiàn)可疑細(xì)胞病變時(shí)應(yīng)繼續(xù)傳代，待細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后－20℃或－70℃凍存；,,

25、三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,（10）一代陽(yáng)性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現(xiàn)，將病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以選用二代病毒進(jìn)行鑒定；（11）如果7d之后沒(méi)有CPE出現(xiàn)，那么盲傳1代繼續(xù)觀察7d。（注意：同一病例標(biāo)本的細(xì)胞培養(yǎng)物不能混在一起再傳代，例如：不同細(xì)胞的培養(yǎng)物應(yīng)單獨(dú)傳代）；（12）盲傳兩代后，仍然沒(méi)有出現(xiàn)CPE的，則判定為陰性；（13）注意：如果接種后24h內(nèi)出現(xiàn)C

26、PE，很可能是標(biāo)本中的非特異性成分導(dǎo)致的毒性反應(yīng)。取,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,100μl陽(yáng)性分離物傳二代，繼續(xù)觀察；或者在接種標(biāo)本吸咐1h后用維持液清洗細(xì)胞層，可能會(huì)降低毒性反應(yīng)；（14）幾個(gè)概念： A：毒性反應(yīng)：如果在接種后1-2d內(nèi)細(xì)胞快速凋亡，這可能是由于標(biāo)本中含有毒性物質(zhì)而導(dǎo)致的非特異性毒性反應(yīng)。這些已接種標(biāo)本的試管應(yīng)在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型細(xì)胞中（此時(shí)是第二代）。如果又出現(xiàn)

27、了毒性反應(yīng)，那么應(yīng)該取原始標(biāo)本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細(xì)胞中。這時(shí)應(yīng)被認(rèn)為是第一代。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,B：微生物污染：由于細(xì)菌污染而造成培養(yǎng)液混濁或細(xì)胞死亡經(jīng)常使病毒造成的CPE無(wú)法確定或根本無(wú)法出現(xiàn)。重新取原始標(biāo)本，用氯仿或抗生素處理，按上述步驟重新接種到新鮮細(xì)胞上。 C：盲傳：有時(shí)一周之后傳代細(xì)胞會(huì)老化，甚至細(xì)胞對(duì)照也出現(xiàn)了病變。這時(shí)已接種標(biāo)本的試管應(yīng)在-20℃凍存，融化后取0.2ml接

28、種到同一類型的新鮮單層細(xì)胞中，再觀察7-10d。如果盲傳兩代后仍然沒(méi)有產(chǎn)生CPE，那么認(rèn)為這個(gè)標(biāo)本是陰性的。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,5．病毒分離結(jié)果解釋 RD細(xì)胞支持HFMD的主要病原體——CVA16和EV71等多種腸道病毒的復(fù)制，CVA16和EV71均能在RD細(xì)胞培養(yǎng)中引起特殊的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加，最后細(xì)胞自管壁脫落。但相同滴度的CVA16和EV7

29、1在RD細(xì)胞中生長(zhǎng)的速度不同，EV71的生長(zhǎng)速度要快于CVA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細(xì)胞后出現(xiàn)CPE的時(shí)間比CVA16早，EV71接種細(xì)胞后出現(xiàn)CPE很快，但CVA16一般要經(jīng)過(guò)2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的CPE。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（一）病毒分離,若在使用RD細(xì)胞分離的同時(shí)再增加HEp-2細(xì)胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其他可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2細(xì)胞中均不繁殖。,

30、,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,,,,,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,比較患者急性期血清與恢復(fù)期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學(xué)診斷方法，最常用的是中和實(shí)驗(yàn)，即用微量板法測(cè)定抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測(cè)的最常用方法，該方法精確且具有型特異性。作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測(cè)定血清中腸道病毒中和抗體的滴度，通常用急性期血清與恢復(fù)期血清滴度進(jìn)

31、行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是，腸道病毒隱性感染也很常見(jiàn)，所以在評(píng)估檢測(cè)結(jié)果時(shí)就要小心一些。在中和實(shí)驗(yàn)中，一般要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,CVA16原型株為G-10株）或流行株，有時(shí)同時(shí)（或單獨(dú)）使用臨床分離株會(huì)有助于得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。 使用對(duì)腸道病毒敏感的細(xì)胞，如RD細(xì)胞。用病毒（血清）稀釋液（

32、下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸液，因?yàn)槭怯貌《緛?lái)確定血清中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原型株），但有時(shí)使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，但分離株的滴度（100 CCID50/0.05ml）要事先測(cè)定。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,中和實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)原理：病毒感染敏感靶細(xì)胞后，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，出現(xiàn)CPE，特異性中和抗體與病毒結(jié)合后，可使病毒顆粒

33、失去感染性，抑制CPE的出現(xiàn)。 1．液體配制,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,2．攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備 （1）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于10支凍存管中，每管1.5ml，一般每管應(yīng)在一次試驗(yàn)中用完，有剩余應(yīng)高壓后廢棄； （2）

34、加Eagle液10倍系列稀釋為10-1至10-8病毒液，各加入細(xì)胞板內(nèi)，每孔50μl，每稀釋度4孔細(xì)胞； （3）每孔加細(xì)胞懸液50μl，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照（50μl稀釋液+50μl細(xì)胞懸液）， 36℃培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞病變； （4）按Behrens-Kärber公式計(jì)算出分離病毒株的CCID50；,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,log CCID50 = L-d (S-0.5)，

35、 其中： L = 實(shí)驗(yàn)中使用的最低稀釋度的對(duì)數(shù)值； d = 稀釋梯度的對(duì)數(shù)值； S = 終判時(shí)陽(yáng)性部分的總和（即出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔所占的比例之和）。 （5）正式試驗(yàn)前應(yīng)先滴定攻擊病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50的病毒載量； （6）按照計(jì)算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗(yàn)所需的病毒總量（即100 CCID

36、50/0.05ml）；,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,（7）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）0.9ml； （8）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已經(jīng)稀釋好的攻擊病毒液（即100CCID50/0.05ml）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產(chǎn)生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1 CCID50/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。

37、,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,3．稀釋血清 （1）發(fā)病1-3d內(nèi)采取患者急性期血清，發(fā)病后2-4周采取恢復(fù)期血清，分別凍存在-20℃?zhèn)錂z。 （2）取無(wú)菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液）0.3ml，加待測(cè)血清0.1ml，蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過(guò)夜，即為1：4稀釋血清。次日56℃、30min滅活。 （3）打開(kāi)獨(dú)立

38、無(wú)菌包裝48孔組織培養(yǎng)板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,使用移液器吸取處理過(guò)的血清0.1ml加入第一孔（即為1:16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（即為1:64），依次至1:1024，血清稀釋的過(guò)程中不必更換吸尖。即每份血清標(biāo)本進(jìn)行4倍倍比稀釋，即1:4、1:16、1:64、1:256、1:1024

39、。 （4）每份血清標(biāo)本的每個(gè)稀釋度都要平行做兩孔。4．病毒中和抗體測(cè)定的操作步驟： （1）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對(duì)）待測(cè)血清，版面設(shè)計(jì)如下圖所示。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，不必更換吸尖，在A3-A4孔（

40、B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，,,三、

41、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）為每份待測(cè)血清對(duì)照孔，每孔中補(bǔ)加稀釋液0.05ml； （2）上述孔中分別加入病毒

42、0.05ml（病毒滴度事先已經(jīng)稀釋為100 CCID50/0.05ml）； （3）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,（4）另取一塊96孔板縱向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核實(shí)（每次實(shí)驗(yàn)都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）0.05

43、ml，然后從0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每個(gè)稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同時(shí)留出4孔做為細(xì)胞對(duì)照孔，每孔加入0.1ml病毒稀釋液，然后放入4℃冰箱中暫存；,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,（5）在孵育期間，用消化液消化細(xì)胞，準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液的濃度為2×

44、105個(gè)/ml，每塊96孔板至少需要準(zhǔn)備10ml；（6）孵育結(jié)束后每個(gè)待測(cè)血清孔、血清對(duì)照孔（待檢標(biāo)本板）和病毒回滴孔和細(xì)胞對(duì)照孔（病毒回滴板）分別加入0.1ml細(xì)胞懸液，然后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育培養(yǎng)；（7）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結(jié)果，以不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)為終點(diǎn)效價(jià)。當(dāng)100 CCID50/0.05ml的病毒對(duì)照孔出現(xiàn)完全病變時(shí)，判定最終結(jié)果（約5~7d）；（8）

45、注意：如果病毒對(duì)照結(jié)果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/0.05ml的范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)無(wú)效，就要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,5．結(jié)果判定當(dāng)最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，另一孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計(jì)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)兩個(gè)相鄰稀釋度血清均出現(xiàn)1

46、孔細(xì)胞病變，另1孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（二）測(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度,對(duì)于HFMD的雙份血清中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)，如果恢復(fù)期血清較急性期血清EV71或CVA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復(fù)期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實(shí)該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)；如果單份血清中和抗體滴度大于1

47、:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽(yáng)性。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,,,,,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,1．RNA提取 可使用多種商業(yè)化試劑盒來(lái)提取RNA，針對(duì)臨床標(biāo)本應(yīng)選擇質(zhì)量較高的“用于臨床標(biāo)本病毒RNA提取的試劑盒”，也可使用全自動(dòng)RNA提取儀進(jìn)行提取。針對(duì)病毒分離物，核酸提取比較容易，大部分商業(yè)化R

48、NA提取試劑盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依據(jù)使用的試劑不同，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,2．逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,,,,,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,2．逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） （1）引物序列合成 國(guó)家脊灰實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)3對(duì)引物，分別為人腸道病毒通用引物、EV71特異性引物和CVA16特異性引物。各省CDC依據(jù)引

49、物序列在質(zhì)量有保證的公司合成,引物合成后,需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)，保證引物合成沒(méi)有質(zhì)量問(wèn)題后,分發(fā)給地市級(jí)CDC。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,1）人腸道病毒（包括EV71、CVA16）核酸檢測(cè)通用引物序列：PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3

50、`,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,2）EV71核酸檢測(cè)引物序列：EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,3）CVA16核酸檢測(cè)引物序列：CVA16-S（上游）：5`-ATT GGT

51、GCT CCC ACT ACA GC-3`CVA16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1）在PCR記錄紙（實(shí)驗(yàn)記錄紙）上記錄本次實(shí)驗(yàn)操作者姓名，實(shí)驗(yàn)日期，所鑒定標(biāo)本的名稱以及標(biāo)本的順序，與PCR儀排列的順序一致。2）標(biāo)記好加標(biāo)本和對(duì)照的PCR管（陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照和試劑對(duì)照）。A：陽(yáng)性對(duì)照：參比RN

52、A，省級(jí)CDC提供（只是在初次使用，常規(guī)不建議使用，以防污染）。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,B：陰性對(duì)照：使用正常細(xì)胞RNA或臨床標(biāo)本腸道病毒陰性的RNA（每次實(shí)驗(yàn)要設(shè)立）。C：試劑對(duì)照：用去離子水代替標(biāo)本（試劑初次使用時(shí)必須做）。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,（3）RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)和條件 1）從臨床標(biāo)本或病毒中提取的RNA和各種

53、RT-PCR試劑應(yīng)該一直放在冰浴盒上； 2）配下列試劑主溶液： 10×PCR Buffer························

54、····································

55、3;5.0μl dNTPs（2.5mM each）······························

56、·····················2.0μl 上游引物（0.1μg/μl）··········

57、····································

58、3;·····1.0μl 下游引物（0.1μg/μl）·························

59、3;··························1.0μl RNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）···&

60、#183;··································0.5μl

61、 Taq DNA聚合酶（5U/μl）································&

62、#183;··············0.5μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（10U/μl）················

63、;································1.0μl 模板RNA&

64、#183;····································

65、;··································3.0μl

66、 RNase Free dH2O·································&

67、#183;························36.0μl

68、 50.0μl,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,3）在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)步驟如下：,42℃················&#

69、183;·······45min95℃························3min95℃··&

70、#183;···············20s45℃··················25s

71、×32個(gè)循環(huán) 72℃························30s72℃·········

72、;···············10min 4℃····················

73、····Soak,,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,3．電泳分析 （1）將已經(jīng)聚合的3%的瓊脂糖凝膠放在電泳裝置上； （2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 電泳載樣緩沖液（每個(gè)反應(yīng)需1μl）。再加上5μl的PCR反應(yīng)產(chǎn)物與之混合； （3）將電泳緩沖液倒在電泳裝置中，用吸尖將樣品與載樣緩沖液的混合溶液加到孔中；

74、 （4）蓋上蓋子，接通電源，以10V/cm電壓（恒定電壓）電泳，大約35-40min，直到溴酚藍(lán)跑到凝膠的底部的時(shí)候，停止電泳；,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,（5）將膠取出，并注意保持凝膠的方向； （6）在1μg/ml的溴化乙錠溶液中染色15min；（注意：溴化乙錠溶液是有毒、致畸、并且致腫瘤的物質(zhì)，操作時(shí)要加小心，并戴雙層手套。如果儲(chǔ)存在避光的容器中，溴化乙錠溶液可以重復(fù)使用。溴化

75、乙錠廢棄物按醫(yī)療廢棄物中化學(xué)品的有關(guān)規(guī)定處理。） （7）在蒸餾水中涮一下凝膠； （8）在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，并照相作記錄。 有條件的實(shí)驗(yàn)室可以使用全自動(dòng)電泳分析儀。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）,4．結(jié)果解釋使用全自動(dòng)電泳分析儀的實(shí)驗(yàn)室可以通過(guò)儀器自動(dòng)讀取PCR產(chǎn)物大小，來(lái)判斷結(jié)果。通過(guò)瓊脂糖凝膠做PCR產(chǎn)物電泳的實(shí)驗(yàn)室，需要參照DNA分子量對(duì)照對(duì)照

76、，比較標(biāo)本的PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照的PCR產(chǎn)物在凝膠上的位置以及大小來(lái)解釋結(jié)果。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋表,,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）,,,,,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）,1. 病毒核酸提取參考常規(guī)RT-PCR病毒核酸提取步驟和注意事項(xiàng)。2. Real-time RT-PCR （r

77、RT-PCR）依據(jù)不同廠家的試劑盒，嚴(yán)格按相應(yīng)說(shuō)明書(shū)操作和判斷結(jié)果。有5種試劑盒，分別為One Step Real-time PCR法檢測(cè)EV71病毒核酸（單通道檢測(cè)）；One Step Real-time PCR法檢測(cè)CVA16核酸（單通道檢測(cè)）；One Step Real-time PCR法檢測(cè)腸道病毒核酸（單通道檢測(cè)）；,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）,One Step

78、Real-time PCR法同時(shí)檢測(cè)EV71和CVA16核酸（雙通道檢測(cè)）；One Step Real-time PCR法同時(shí)檢測(cè)EV71和腸道病毒核酸（雙通道檢測(cè)）。下面舉2個(gè)例子來(lái)說(shuō)明單通道檢測(cè)和雙通道檢測(cè)的操作規(guī)程和注意事項(xiàng)。（1） One Step Real-time PCR法檢測(cè)EV71病毒核酸（單通道檢測(cè)）①反應(yīng)體系配置：反應(yīng)體系共25μl，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5μl的RNA模板量），不夠部分以

79、水補(bǔ)足。如選用另外試劑盒，反應(yīng)體系及條件隨之變化。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）,a.從試劑盒中取出相應(yīng)的試劑，反應(yīng)液在室溫融化后，瞬時(shí)離心，按n+1配置反應(yīng)體系（n=樣本數(shù)+1管陽(yáng)性對(duì)照+1管陰性對(duì)照），每個(gè)測(cè)量反應(yīng)體系配置如下表：,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）,b.將上述反應(yīng)液混勻離心后，按照每管20μL分裝于各熒光P

80、CR儀適用的PCR管中。c.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應(yīng)管中，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補(bǔ)足?？偡磻?yīng)體積25μL。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,②熒光RT-PCR循環(huán)條件設(shè)置,(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）,③對(duì)照設(shè)置陰性對(duì)照：核酸提取時(shí)以滅

81、菌雙蒸水代替標(biāo)本，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立。陽(yáng)性對(duì)照：由省級(jí)實(shí)驗(yàn)室提供EV71陽(yáng)性核酸（只在評(píng)價(jià)試劑時(shí)使用）④結(jié)果分析條件設(shè)定和結(jié)果判斷閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)，或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。Ct值≤35.0的樣本為陽(yáng)性。38.0> Ct值>35.0的樣本為臨界值。Ct值≥38.0的樣本或無(wú)數(shù)值的標(biāo)本為陰性。,,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,(四) Real-time RT-

82、PCR （rRT-PCR）,（2） One Step Real-time PCR法同時(shí)檢測(cè)EV71和CVA16核酸（雙通道檢測(cè)）雙通道可以同時(shí)檢測(cè)EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短時(shí)間(2.5小時(shí))內(nèi)檢測(cè)到標(biāo)本中是否含EV71或CVA16核酸。①反應(yīng)體系配置反應(yīng)體系共25μl，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5μl模板量），不夠部分以水補(bǔ)足。如選用另外試劑盒，反應(yīng)體系及條件隨之變化。,,三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程,