基因免疫構(gòu)成和機(jī)理

1、基因免疫構(gòu)成和機(jī)理(GeicImmunity)基因免疫，又稱基因疫苗免疫或核酸免疫；是應(yīng)用基因重組技術(shù)將編碼的目的抗原蛋白基因插入細(xì)菌質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建成重組體，將其直接導(dǎo)入動物機(jī)體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，表達(dá)抗原蛋白，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性體液免疫及以CTL為代表的細(xì)胞免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。這種能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重組體，就是核酸疫苗，或稱基因疫苗(geicvaccine)、裸DNA疫苗(DNAvaccin

2、e)等，系該章討論的重點(diǎn)內(nèi)容。基因直接導(dǎo)入法最初用于基因治療試驗(yàn)。人們發(fā)現(xiàn)將基因直接在體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，目的基因亦可在機(jī)體內(nèi)表達(dá)。1990年Wolff等總結(jié)了前人的成果，并對此進(jìn)行了較深入的研究。他們將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)、蟲熒光素酶基因(Luc)及β—半乳糖苷酶基因(LacZ)分別直接注射到小鼠的骨骼肌內(nèi)，結(jié)果表明在肌肉組織可分別檢測到三種基因產(chǎn)物，它們的表達(dá)量可與在體外最佳條件下轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞的表達(dá)量相當(dāng)，兩個月以后，肌肉內(nèi)

3、還可檢測到蟲熒光素酶。據(jù)此，他們認(rèn)為向機(jī)體直接導(dǎo)入基因以表達(dá)抗原蛋白，可以作為一種免疫接種法。1992年Tang等將人生長激素基因的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入小鼠表皮細(xì)胞，幾周后，88%(30／34)的小鼠產(chǎn)生了抗人生長激素的抗體。此后，許多學(xué)者先后將不同病原的保護(hù)性抗原基因直接導(dǎo)入到不同的動物體內(nèi)，均引起了特異性的免疫應(yīng)答，不僅誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，也刺激產(chǎn)生體液免疫。目前，基因疫苗已成為繼減毒疫苗及基因工程疫苗之后，正在興起研究的第三代疫苗，巴斯德研究

4、所的Whalen博士在Inter網(wǎng)上建立了有關(guān)基因疫苗研究的網(wǎng)址，每周發(fā)布2～3次新聞，內(nèi)容主要包括:最新消息，會議訊息，研究進(jìn)展，最新文獻(xiàn)，有關(guān)基因疫苗研究試劑與器材的供求信息等。一、基因疫苗的構(gòu)成基因疫苗由病原的保護(hù)性抗原基因及載體質(zhì)粒兩部分構(gòu)成。保護(hù)性抗原基因可以是單個基因，也可以是具有協(xié)同保護(hù)功能的一組基因，也可以是編碼抗原決定簇的一段核苷酸序列。對載體質(zhì)粒的一般要求是：①在大腸桿菌中可以高拷貝地擴(kuò)增；②在動物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)

5、，但不能復(fù)制，也不能含有促進(jìn)整合入宿主細(xì)胞染色體基因組的序列。載體質(zhì)粒一般以pUC質(zhì)粒為基本骨架，帶有細(xì)菌復(fù)制子(I)，真核生物的啟動子，有的還含有增強(qiáng)子和多聚A加尾信號。啟動子多數(shù)來源于病毒基因組，如CMV，RSV和LTR等，具有較高的轉(zhuǎn)錄活性。在所有研究過的啟動子中，以CMV的轉(zhuǎn)錄活性最高，其中又以帶intronA的轉(zhuǎn)錄活性為高，intronA內(nèi)部含有某些轉(zhuǎn)錄因子的加尾信號，可能是其促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的原因。二、基因免疫的機(jī)理目前，人們對

6、基因的免疫機(jī)理尚不十分清楚。給動物肌肉接種基因疫苗后，外源基因在肌纖維細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)加工成多肽抗原，然后與宿主的MHCⅠ類或MHCⅡ類分子結(jié)合，再將其結(jié)合物遞呈給ICC，從而引發(fā)特異性免疫應(yīng)答。目前，人們對這一抗原遞呈過程所知甚少，一般認(rèn)為樹突狀細(xì)胞(DC)在該過程中起重要作用，因?yàn)?，在肌肉中發(fā)現(xiàn)存在有DC，但這并沒有直接的抗原遞呈實(shí)驗(yàn)證據(jù)。Raz等(1994)將基因含流感病毒NP的質(zhì)粒皮下接種小鼠，接種后分別在第

7、3、10和30天用免疫組化法染色接種部位，發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞有：角質(zhì)化細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞。說明這些細(xì)胞在動物接種基因疫苗后的免疫應(yīng)答中起作用。關(guān)于肌細(xì)胞在基因疫苗免疫機(jī)理中的作用，目前有以下三種觀點(diǎn)：①肌細(xì)胞直接參與特異性。因?yàn)橐詐CMVOVA替代pCMVlacZ進(jìn)行第二次免疫，并不出現(xiàn)這種抑制作用。因此，作者認(rèn)為以編碼過敏原的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行免疫有可能用于過敏性疾病的治療。（五）基因免疫可使無反應(yīng)性動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答如以HBsAg表

8、達(dá)質(zhì)粒免疫HBsAg轉(zhuǎn)基因鼠，亦可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，而在一般情況下，HBsAg轉(zhuǎn)基因鼠對HBsAg是不產(chǎn)生免疫應(yīng)答的。（六）基因疫苗與一些細(xì)胞因子的表達(dá)質(zhì)粒共同免疫，可使免疫應(yīng)答類型發(fā)生改變?nèi)缗cIL12和IFNγ表達(dá)質(zhì)粒共同免疫，基因疫苗的免疫應(yīng)答類型主要是Th1，而Th2反應(yīng)受到抑制。相反，IL4表達(dá)質(zhì)?？娠@著增強(qiáng)Th2反應(yīng)，而Th1反應(yīng)受到抑制。另外，基因疫苗接種新生動物可誘導(dǎo)出較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，不受或較少受母源抗體的影響

9、。基因疫苗質(zhì)粒既是抗原信息的攜帶者，同時又具有佐劑作用。五、影響基因疫苗免疫效果的因素（一）保護(hù)性抗原基因的選擇應(yīng)選擇病原體的主要保護(hù)性抗原基因，也可以將具有協(xié)同功能的基因共同組裝入載體質(zhì)粒。同時，還應(yīng)注意盡可能選擇對多數(shù)毒株都有保護(hù)作用的抗原基因。另外，保護(hù)性抗原基因編碼的抗原結(jié)構(gòu)，對DNA疫苗的免疫應(yīng)答水平也能產(chǎn)生一定影響，如信號肽序列的有無，密碼子的使用情況，抗原蛋白的穩(wěn)定性，抗原蛋白是膜結(jié)合型，還是分泌型等，制苗時都應(yīng)予以充

10、分考慮。（二）載體質(zhì)粒的選擇除上述載體的啟動子和終止子等是影響基因疫苗免疫應(yīng)答水平的重要元件外，還有載體內(nèi)部其它一些序列和載體質(zhì)粒的狀態(tài)亦影響基因疫苗的應(yīng)答水平。Montgomcry等比較了兩種含流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NP)基因的質(zhì)粒V1和VJ1在小鼠體內(nèi)的表達(dá)效果。V1的骨架來自pBR322，而VJ1的骨架為pUC19。結(jié)果表明VJ1的表達(dá)水平明顯高于V1的水平。兩者的啟動子，增強(qiáng)子，加尾信號等均相同，所不同者，除質(zhì)粒骨架有異外，還在

11、VJ1的啟動子CMV內(nèi)去掉了一段500bp的序列，而V1的啟動子未作任何改造。實(shí)驗(yàn)表明：這段序列含有基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控區(qū)，可抑制基因在COS1細(xì)胞和CHO細(xì)胞中的表達(dá)。Danko等發(fā)現(xiàn)，共價閉環(huán)(CCC)型質(zhì)粒pRSCLDNA的表達(dá)效果遠(yuǎn)高于線性化質(zhì)粒pRSVLDNA。但Sakaguchi等在對新城疫基因疫苗的研究中卻發(fā)現(xiàn)線性化的質(zhì)粒優(yōu)于閉環(huán)質(zhì)粒。（三）免疫刺激序列的作用人們發(fā)現(xiàn)6核苷酸鏈：5′RRGCYY3′(R=A或G、Y=C或T)

12、具有較強(qiáng)的非特異性免疫增強(qiáng)作用，該序列被稱為免疫刺激序列(ISS)，他可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFNγ、IL6、IL12、TNF，以及促進(jìn)B細(xì)胞的增殖，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答強(qiáng)度。Sato等(1996)證實(shí)：天然含有ISS的核酸疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平較不含ISS的要高20余倍。ISS在基因疫苗中的作用已受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。（四）免疫調(diào)節(jié)因子在DNA疫苗中的作用為提高DNA疫苗的免疫應(yīng)答水平，許多研究者將免疫調(diào)節(jié)因子的基因克隆到DNA疫苗質(zhì)粒中，使

13、之與病原的保護(hù)性抗原基因共同表達(dá)，以促進(jìn)基因疫苗的免疫應(yīng)答水平。如Larsent等將人的IL6基因與馬流感病毒的血凝素(HA)基因共同構(gòu)建成疫苗質(zhì)粒，以其接種小鼠，小鼠可以抵抗馬流感病毒的攻擊，而接種僅含HA基因的質(zhì)粒的小鼠卻只能減輕病毒攻擊后的感染。Kim等將IL12和GMCSF基因分別與HIV1的疫苗質(zhì)粒共同免疫小鼠。結(jié)果IL12抑制特異性抗體的產(chǎn)生，但卻使免疫應(yīng)答的類型由Th2轉(zhuǎn)向Th1，并顯著促進(jìn)特異性CTL反應(yīng)。已被用于這一目

14、的免疫調(diào)節(jié)因子種類很多，除上述提到的外，還有IL1、IL4、IL5、IL10、IL15、IL18、TNFα、TNFβ、IFNγ等細(xì)胞因子和CD28、CD86(B72)、CD80(B71)等共同刺激因子。（五）基因疫苗質(zhì)粒的純化基因轉(zhuǎn)移對質(zhì)粒的質(zhì)量要求非常高。質(zhì)粒應(yīng)該主要以超螺旋形式存在，無蛋白，脂多糖(LPS)含量低。由于基因疫苗所需質(zhì)粒數(shù)量較大，因此，提取質(zhì)粒的回收率應(yīng)該較高才能滿足要求。早期主要用CsCl密度梯度離心法獲得高質(zhì)量的