電脈沖介導(dǎo)的DNA疫苗骨骼肌內(nèi)免疫接種的轉(zhuǎn)基因長期表達(dá)和抗原遞呈機(jī)理的研究.pdf

1、電脈沖介導(dǎo)的 DNA 免疫 (DNA+EP) 可以明顯增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果.但其中的作用機(jī)理不明確,我們希望從DNA+EP免疫轉(zhuǎn)基因表達(dá),和DNA+EP免疫后抗原遞呈兩個(gè)角度,討論其中的具體過程和作用機(jī)理. 我們發(fā)現(xiàn),DNA+EP 免疫對作用區(qū)域的骨骼肌會造成一定程度的損傷,骨骼肌的創(chuàng)傷隨著離電極距離增加而減弱.在電極附近,電脈沖將骨骼肌的肌束膜和肌內(nèi)膜擊穿,釋放出游離的肌細(xì)胞,這些肌細(xì)胞由于受到過度損傷而發(fā)生橫紋肌溶解導(dǎo)致壞死/凋

2、亡;在離電極較遠(yuǎn)的區(qū)域,電脈沖僅將肌束膜擊穿,釋放出游離的肌細(xì)胞,但并不會引起這些細(xì)胞壞死/凋亡. DNA+EP 免疫對骨骼肌的損傷將在局部區(qū)域引發(fā)較嚴(yán)重的炎癥反應(yīng).DNA+EP作用2小時(shí)后,受損傷部位的骨骼肌中有大量的血球滲出,這些細(xì)胞多數(shù)是多形核細(xì)胞.到第3天,炎癥浸潤細(xì)胞中多電脈沖介導(dǎo)的DNA疫苗骨骼肌內(nèi)免疫接種的轉(zhuǎn)基因長期表達(dá)和抗原遞呈機(jī)理的研究數(shù)是單個(gè)核細(xì)胞.作用5-7天后,骨骼肌中的炎癥浸潤細(xì)胞最多;作用14天后,炎

3、癥反應(yīng)逐漸減輕成為灶性炎癥并最終大約于21天后基本消退. 在炎癥反應(yīng)的早期,免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示骨骼肌中的浸潤細(xì)胞主要為炎癥性巨噬細(xì)胞,很少CDllc陽性細(xì)胞即DC細(xì)胞.直到DNA+EP作用后第14天,炎癥浸潤細(xì)胞才出現(xiàn).DC細(xì)胞;炎癥性DC細(xì)胞存在于骨骼肌中至電脈沖作用后第21天炎癥基本消失時(shí)為止. 在炎癥反應(yīng)中后期,炎癥浸潤細(xì)胞中還有大量T細(xì)胞.CD4<'+>T細(xì)胞和CD8<'+>T細(xì)胞都在電脈沖作用后第5天即可在骨

4、骼中檢測到。CD4<'+>T細(xì)胞在電脈沖作用后第7天時(shí)數(shù)量達(dá)到最多；CD8<'+>T細(xì)胞在電脈沖作用后第14天時(shí)數(shù)量達(dá)到最多。CD4<'+>T細(xì)胞和CD8<'+>T細(xì)胞存在于骨骼肌中直到電脈沖作用后第21天.由于這些T細(xì)胞浸潤表達(dá)抗原的肌細(xì)胞,因此它們可能是抗原特異性的. DNA+EP引起的炎癥細(xì)胞浸潤一方面是由于骨骼肌中由于大量趨化因子基因表達(dá)增加,對炎癥細(xì)胞趨化的結(jié)果.cDNA芯片分析顯示:DNA+EP作用2小時(shí)后MIP-1

5、a基因表達(dá)增加約8倍,MIP-1B基因表達(dá)增加約4倍,MIP-1γ,基因表達(dá)增加約4倍,MIP-3a基因表達(dá)增加約3倍,MCP-2基因表達(dá)增加約3倍,IP-10基因表達(dá)增加約10倍,lvmphotactin基因表達(dá)增加約27倍,fractalkine基因表達(dá)增加約9倍.DNA+EP還引起骨骼肌中趨化因子受體基因表達(dá)增加.DNA+EP作用2小時(shí)后,CCR5基因表達(dá)增加約5倍,CXCR-4基因表達(dá)增加約4倍. DNA+EP引起的炎癥

6、細(xì)胞浸潤另一方面是骨骼肌中由于大量細(xì)胞壞死/凋亡,需要吞噬細(xì)胞如多形核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞清除細(xì)胞碎片.DNA+EP作用2小時(shí)后Caspase-8基因表達(dá)增加230倍.Caspase-1基因表達(dá)增加了44倍.cyplal基因表達(dá)增加了37倍,cypla2基因表達(dá)增加了59倍,MT2基因表達(dá)增加了6倍. DNA+EP作用后,引流淋巴結(jié)中單核細(xì)胞數(shù)量沒有明顯變化.但是引流淋巴結(jié)中的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加約一倍,DCs細(xì)胞數(shù)量增加約3倍.而且,D

7、NA+EP作用后,引流淋巴結(jié)中CCR-1～CCR-9等趨化因子受體基因表達(dá)增加,顯示T細(xì)胞活化. DNA+EP作用后,組織中的炎癥性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞可以通過兩種方式獲得抗原(GFP).第一,一些炎癥性單核細(xì)胞/巨噬可以通過攝取質(zhì)粒DNA然后內(nèi)源性表達(dá)抗原(直接轉(zhuǎn)染).第二,大多數(shù)炎癥性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞通過吞噬肌細(xì)胞分泌的外源蛋白得到抗原.同時(shí),在引流淋巴結(jié)的T細(xì)胞區(qū)域可以觀察到裝載了抗原(GFP,QDs)的炎癥性單核細(xì)胞/巨

8、噬細(xì)胞.顯示炎癥性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞可能有抗原遞呈的作用. 應(yīng)用新的DNA免疫策略,我們發(fā)現(xiàn):EP+3d+DNA免疫比EP+1d+DNA免疫或EP+DNA免疫可以更加迅速的誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答.而且免疫后2周時(shí)EP+3d+DNA免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平顯著高于EP+1d+DNA免疫或EP+DNA免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平(P<0.05).雖然在免疫后4周時(shí)EP+3d+DNA免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平與EP+DNA免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平相當(dāng),仍

9、然顯著高于EP+1d+DNA誘導(dǎo)的中和抗體水平(P<0.05).以上結(jié)果由兩方面原因引起:一,DNA+EP免疫產(chǎn)生的抗原比EP+1d+DNA免疫產(chǎn)生的抗原多400倍以上.二,骨骼肌中的炎癥性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的數(shù)量在EP+3d+DNA免疫中DNA接種時(shí)比在EP+1d+DNA免疫中DNA接種時(shí)多. 此外,將重組乙肝表面蛋白(HBS)通過EP+3d+HBS免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)預(yù)先誘導(dǎo)骨骼肌產(chǎn)生炎癥性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤也有助于增強(qiáng)蛋白疫

10、苗引起的免疫應(yīng)答. 而且,從EP+3d+DNA免疫和DNA+EP免疫的小鼠的引流淋巴結(jié)中分離出來的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞比從直接肌肉內(nèi)注射DNA免疫的小鼠的引流淋巴結(jié)中分離出來的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞更能有效誘導(dǎo)同種基因的、抗原特異性的CD4<'+>T細(xì)胞在體外增殖. 以上結(jié)果表明,炎癥性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是DNA+EP免疫后主要的抗原遞呈細(xì)胞. 另一方面,我們發(fā)現(xiàn)在DNA+EP作用后2小時(shí),骨骼肌中MyoD基因開始轉(zhuǎn)錄

11、;DNA+EP作用后1天,電脈沖的電極附近的單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)MyoD蛋白.DNA+EP作用后第3天,電極附近的肌細(xì)胞發(fā)生橫紋肌溶解留下大片空隙.DNA+EP作用后第5天,肌細(xì)胞開始再生.DNA+EP作用后第7天,再生的肌細(xì)胞重新形成肌束.DNA+EP免疫后14天.21天,再生骨骼肌體積增大.DNA+EP免疫后60天,受傷的骨骼肌基本恢復(fù)正常.結(jié)果顯示,DNA+EP激活了衛(wèi)星細(xì)胞并分化成再生肌細(xì)胞. 應(yīng)用質(zhì)粒DNA標(biāo)記系統(tǒng),我們發(fā)

12、現(xiàn)質(zhì)粒DNA在骨骼肌中的分布可分成兩部分:在離電極較遠(yuǎn)的區(qū)域,質(zhì)粒DNA主要分布在肌細(xì)胞的間隙;在電極附近區(qū)域,質(zhì)粒DNA主要分布在活化的衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi). 對DNA+EP作用后骨骼肌中報(bào)道基因GFP表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)研究表明:第1天, GFP主要表達(dá)在游離的肌細(xì)胞中;第3.5天, G:FP主要表達(dá)在離電極較遠(yuǎn)的區(qū)域的預(yù)先存在的肌細(xì)胞中,同時(shí)用confocal顯微鏡可以在新生肌中觀察到GFP表達(dá);第7天,預(yù)先存在的肌細(xì)胞中的GFP表達(dá)減少,

13、同時(shí),由于新生肌細(xì)胞體積增大,新生肌細(xì)胞中表達(dá)的GFP也有所增加,在confocal顯微鏡可以更加容易觀察到;第14-21天,預(yù)先存在的肌細(xì)胞中的GFP表達(dá)逐漸減少至觀察不到;但是同時(shí)隨著再生肌細(xì)胞體積增大,再生肌細(xì)胞中表達(dá)的GFP大量增加以至在普通顯微鏡下也可以觀察到.結(jié)果進(jìn)一步顯示,質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染了骨骼肌中的衛(wèi)星細(xì)胞,衛(wèi)星細(xì)胞分化而來的電脈沖介導(dǎo)的DNA疫苗骨骼肌內(nèi)免疫接種的轉(zhuǎn)基因長期表達(dá)和抗原遞呈機(jī)理的研究再生肌細(xì)胞是骨骼肌中長期

14、表達(dá)轉(zhuǎn)基因的主要原因之一.應(yīng)用Luciferase報(bào)道基因定量研究DNA+EP作用后基因表達(dá),結(jié)果表明持續(xù)中高水平(約為最高值的1/20)的基因表達(dá)可維持?jǐn)?shù)周(基因輸送后28天). 綜上所述:一方面,DNA+EP免疫引起較嚴(yán)重的以單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞為主的炎癥反應(yīng),多數(shù)炎癥性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞通過吞噬肌細(xì)胞表達(dá)的抗原、少數(shù)可能通過吞噬DNA后表達(dá)抗原(直接轉(zhuǎn)染),然后遞呈抗原,致敏免疫系統(tǒng).但是,引流淋巴結(jié)中的DCs可能也起到了抗