草魚免疫細(xì)胞和免疫相關(guān)基因研究：自然殺傷細(xì)胞殺傷活性和溶菌酶mRNA的表達(dá).pdf

1、傳統(tǒng)治療魚病的方法面臨著嚴(yán)峻的藥物殘留、環(huán)境破壞和食品安全的考驗(yàn)。為更好地了解營養(yǎng)支持和非營養(yǎng)性添加劑溶菌酶制品對草魚免疫力維持的重要性和可能的防病、治病作用,進(jìn)一步探討草魚的免疫機(jī)制和免疫調(diào)控機(jī)理,本論文重點(diǎn)研究自然殺傷細(xì)胞殺傷活性和溶菌酶 mRNA的表達(dá),具體內(nèi)容如下。
　　一、實(shí)驗(yàn)選取平均體質(zhì)量(31.86±1.47)g的草魚,隨機(jī)分為2個試驗(yàn)組,對照組(CG)和饑餓組(SG),每組三個平行,饑餓處理15、30、45和60

2、d,測定饑餓對草魚的生長指標(biāo)、肌肉生化組成、血液生化指標(biāo)、蛋白質(zhì)代謝、機(jī)體自然殺傷(NK)細(xì)胞的殺傷活性、血清和肝胰臟中溶菌酶活性和血清中堿性磷酸酶活性的影響。
　　1、饑餓組肥滿度、臟體比、肝體比顯著低于對照組。隨著饑餓時間的延長,草魚肌肉中的水分含量逐漸增加,脂肪和蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)降低趨勢,脂肪含量在四個時期沒有明顯的差異(P>0.05),水分和蛋白質(zhì)含量分別呈現(xiàn)差異性增加和降低的趨勢。血清總蛋白在饑餓15 d時與對照組沒有明顯

3、的差異(P>0.05),其后三個時期對照組顯著高于饑餓組(P<0.05),但饑餓組后三個時期趨于穩(wěn)定。
　　2、隨著饑餓時間的延長,白蛋白、總膽固醇和甘油三脂含量在四個時期與對照組都有顯著變化(P<0.05),饑餓組總體呈現(xiàn)先降低后升高再降低的波浪形變化。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性15 d、60 d時與對照組沒有明顯的變化(P>0.05),在30 d時先降低,45 d時顯著升高(P<0.05)。隨著饑餓時間的延長,與對照組相比 RNA:

4、DNA在肌肉中沒有明顯的差異(P>0.05),在肝胰臟中與對照組呈現(xiàn)顯著性差異,隨著時間的延長饑餓組呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢。
　　3、谷氨酸脫氫酶活性在肌肉中于饑餓15 d時與對照組沒有明顯差異(P<0.05),其后比對照組顯著增加,隨著時間的延長饑餓組谷氨酸脫氫酶活性呈現(xiàn)上升的趨勢;在血清中15 d、45 d時與對照組沒有明顯的變化(P>0.05),在30 d、45 d時顯著升高(P<0.05)。肝胰臟中谷氨酸脫氫酶活性在四個時

5、期比對照組有顯著的增加;與肌肉相比,肝胰臟和血清中谷氨酸脫氫酶活性是一種有效的反應(yīng)蛋白質(zhì)分解代謝的指標(biāo)。
　　4、受饑餓脅迫的影響,草魚自然殺傷性細(xì)胞在脾和頭腎中的殺傷活性顯著低于對照組(P<0.05)且不隨著饑餓時間的延長發(fā)生顯著性變化;隨著饑餓時間的延長,血清和肝胰臟中溶菌酶呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,血清堿性磷酸酶在饑餓15 d、45 d、60 d時顯著低于對照組;饑餓組的堿性磷酸酶活性在饑餓30 d以后,維持恒定。相比較而言,

6、自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性在反映魚類免疫狀況時比溶菌酶和堿性磷酸酶可能更為靈敏。
　　總之,草魚對體內(nèi)貯能物質(zhì)(蛋白質(zhì)和脂肪)的動用并不是簡單地與饑餓時間線性相關(guān),而是出現(xiàn)周期性和階段性起伏的變化;同時饑餓降低了魚類的非特異免疫水平。
　　二、試驗(yàn)隨機(jī)選取平均體質(zhì)量為(6.93±0.27) g的草魚,設(shè)置為5個試驗(yàn)組(D1、D2、D3、D4、D5),每個試驗(yàn)組5個平行,分別飼喂添加溶菌酶制品0,100,200,300和400 m

7、g/kg的試驗(yàn)飼料。于試驗(yàn)進(jìn)行30 d、45 d、60 d時采集頭腎、脾、腸、肝胰臟,測定三個階段下,飼用溶菌酶對草魚生長指標(biāo)、NK細(xì)胞殺傷活性、溶菌酶活性、c型和g型溶菌酶 mRNA的相對表達(dá)量的影響。
　　1、隨著溶菌酶添加量的增加,特定生長率并未呈現(xiàn)顯著性增加的趨勢,在飼喂60 d時,D2和D3組與對照組無顯著性的差異;在試驗(yàn)結(jié)束時 D3(200 mg/kg)組餌料系數(shù)顯著低于其它各試驗(yàn)組。
　　2、在飼喂30 d時

8、D3(200 mg/kg) NK細(xì)胞頭腎和脾中的殺傷活性顯著高于對照組;隨著飼喂時間的增加,高劑量的溶菌酶添加組提高了草魚 NK細(xì)胞的殺傷活性。飼喂30 d時,溶菌酶活性在高劑量的添加組活性顯著高于對照組,在飼喂45 d時與30 d基本相同(頭腎除外);在飼喂60 d時隨著添加量的增加呈現(xiàn)不變或降低的趨勢(頭腎除外)。NK細(xì)胞活性和溶菌酶活性與溶菌酶劑量、存在組織和作用的時間相關(guān)。
　　3、飼用溶菌酶制品對內(nèi)源溶菌酶基因表達(dá)的影響

9、因所在組織、基因型、飼喂時間的不同而不同;從基因型來說,g-type溶菌酶的表達(dá)量升幅較大,變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時400mg/kg組有相對較高的表達(dá)量;c-type溶菌酶的表達(dá)水平在各階段各組織差異較大。從作用組織來說,肝胰臟和腸的g-type溶菌酶相對表達(dá)量升幅較小,頭腎和脾較大;從飼喂時間來說,45 d各基因組的表達(dá)量相對較低。
　　4、在轉(zhuǎn)錄水平上,飼用溶菌酶制品刺激了內(nèi)源溶菌酶 mRNA的表達(dá),在飼喂30 d時