草魚免疫細(xì)胞和免疫相關(guān)基因研究：自然殺傷細(xì)胞殺傷活性和溶菌酶mRNA的表達(dá).pdf

1、傳統(tǒng)治療魚病的方法面臨著嚴(yán)峻的藥物殘留、環(huán)境破壞和食品安全的考驗(yàn)。為更好地了解營(yíng)養(yǎng)支持和非營(yíng)養(yǎng)性添加劑溶菌酶制品對(duì)草魚免疫力維持的重要性和可能的防病、治病作用,進(jìn)一步探討草魚的免疫機(jī)制和免疫調(diào)控機(jī)理,本論文重點(diǎn)研究自然殺傷細(xì)胞殺傷活性和溶菌酶 mRNA的表達(dá),具體內(nèi)容如下。
　　一、實(shí)驗(yàn)選取平均體質(zhì)量(31.86±1.47)g的草魚,隨機(jī)分為2個(gè)試驗(yàn)組,對(duì)照組(CG)和饑餓組(SG),每組三個(gè)平行,饑餓處理15、30、45和60

2、d,測(cè)定饑餓對(duì)草魚的生長(zhǎng)指標(biāo)、肌肉生化組成、血液生化指標(biāo)、蛋白質(zhì)代謝、機(jī)體自然殺傷(NK)細(xì)胞的殺傷活性、血清和肝胰臟中溶菌酶活性和血清中堿性磷酸酶活性的影響。
　　1、饑餓組肥滿度、臟體比、肝體比顯著低于對(duì)照組。隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),草魚肌肉中的水分含量逐漸增加,脂肪和蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì),脂肪含量在四個(gè)時(shí)期沒有明顯的差異(P>0.05),水分和蛋白質(zhì)含量分別呈現(xiàn)差異性增加和降低的趨勢(shì)。血清總蛋白在饑餓15 d時(shí)與對(duì)照組沒有明顯

3、的差異(P>0.05),其后三個(gè)時(shí)期對(duì)照組顯著高于饑餓組(P<0.05),但饑餓組后三個(gè)時(shí)期趨于穩(wěn)定。
　　2、隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),白蛋白、總膽固醇和甘油三脂含量在四個(gè)時(shí)期與對(duì)照組都有顯著變化(P<0.05),饑餓組總體呈現(xiàn)先降低后升高再降低的波浪形變化。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性15 d、60 d時(shí)與對(duì)照組沒有明顯的變化(P>0.05),在30 d時(shí)先降低,45 d時(shí)顯著升高(P<0.05)。隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),與對(duì)照組相比 RNA:

4、DNA在肌肉中沒有明顯的差異(P>0.05),在肝胰臟中與對(duì)照組呈現(xiàn)顯著性差異,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)饑餓組呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)。
　　3、谷氨酸脫氫酶活性在肌肉中于饑餓15 d時(shí)與對(duì)照組沒有明顯差異(P<0.05),其后比對(duì)照組顯著增加,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)饑餓組谷氨酸脫氫酶活性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì);在血清中15 d、45 d時(shí)與對(duì)照組沒有明顯的變化(P>0.05),在30 d、45 d時(shí)顯著升高(P<0.05)。肝胰臟中谷氨酸脫氫酶活性在四個(gè)時(shí)

5、期比對(duì)照組有顯著的增加;與肌肉相比,肝胰臟和血清中谷氨酸脫氫酶活性是一種有效的反應(yīng)蛋白質(zhì)分解代謝的指標(biāo)。
　　4、受饑餓脅迫的影響,草魚自然殺傷性細(xì)胞在脾和頭腎中的殺傷活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)且不隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著性變化;隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),血清和肝胰臟中溶菌酶呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),血清堿性磷酸酶在饑餓15 d、45 d、60 d時(shí)顯著低于對(duì)照組;饑餓組的堿性磷酸酶活性在饑餓30 d以后,維持恒定。相比較而言,

6、自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性在反映魚類免疫狀況時(shí)比溶菌酶和堿性磷酸酶可能更為靈敏。
　　總之,草魚對(duì)體內(nèi)貯能物質(zhì)(蛋白質(zhì)和脂肪)的動(dòng)用并不是簡(jiǎn)單地與饑餓時(shí)間線性相關(guān),而是出現(xiàn)周期性和階段性起伏的變化;同時(shí)饑餓降低了魚類的非特異免疫水平。
　　二、試驗(yàn)隨機(jī)選取平均體質(zhì)量為(6.93±0.27) g的草魚,設(shè)置為5個(gè)試驗(yàn)組(D1、D2、D3、D4、D5),每個(gè)試驗(yàn)組5個(gè)平行,分別飼喂添加溶菌酶制品0,100,200,300和400 m

7、g/kg的試驗(yàn)飼料。于試驗(yàn)進(jìn)行30 d、45 d、60 d時(shí)采集頭腎、脾、腸、肝胰臟,測(cè)定三個(gè)階段下,飼用溶菌酶對(duì)草魚生長(zhǎng)指標(biāo)、NK細(xì)胞殺傷活性、溶菌酶活性、c型和g型溶菌酶 mRNA的相對(duì)表達(dá)量的影響。
　　1、隨著溶菌酶添加量的增加,特定生長(zhǎng)率并未呈現(xiàn)顯著性增加的趨勢(shì),在飼喂60 d時(shí),D2和D3組與對(duì)照組無顯著性的差異;在試驗(yàn)結(jié)束時(shí) D3(200 mg/kg)組餌料系數(shù)顯著低于其它各試驗(yàn)組。
　　2、在飼喂30 d時(shí)

8、D3(200 mg/kg) NK細(xì)胞頭腎和脾中的殺傷活性顯著高于對(duì)照組;隨著飼喂時(shí)間的增加,高劑量的溶菌酶添加組提高了草魚 NK細(xì)胞的殺傷活性。飼喂30 d時(shí),溶菌酶活性在高劑量的添加組活性顯著高于對(duì)照組,在飼喂45 d時(shí)與30 d基本相同(頭腎除外);在飼喂60 d時(shí)隨著添加量的增加呈現(xiàn)不變或降低的趨勢(shì)(頭腎除外)。NK細(xì)胞活性和溶菌酶活性與溶菌酶劑量、存在組織和作用的時(shí)間相關(guān)。
　　3、飼用溶菌酶制品對(duì)內(nèi)源溶菌酶基因表達(dá)的影響

9、因所在組織、基因型、飼喂時(shí)間的不同而不同;從基因型來說,g-type溶菌酶的表達(dá)量升幅較大,變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)400mg/kg組有相對(duì)較高的表達(dá)量;c-type溶菌酶的表達(dá)水平在各階段各組織差異較大。從作用組織來說,肝胰臟和腸的g-type溶菌酶相對(duì)表達(dá)量升幅較小,頭腎和脾較大;從飼喂時(shí)間來說,45 d各基因組的表達(dá)量相對(duì)較低。
　　4、在轉(zhuǎn)錄水平上,飼用溶菌酶制品刺激了內(nèi)源溶菌酶 mRNA的表達(dá),在飼喂30 d時(shí)