雞NLRC5基因在免疫反應中調(diào)控機理的初步研究.pdf

1、NOD樣受體家族CARD結(jié)構(gòu)域包含分子5(NLR family, CARD domain containing5，NLRC5)在調(diào)控天然免疫和細胞免疫中發(fā)揮重要作用，到目前為止，NLRC5已經(jīng)被證實在人和小鼠中可以調(diào)控MHCⅠ類分子的表達，并對NF-κB以及Ⅰ型干擾素分子通路具有抑制性調(diào)控作用。白痢沙門氏菌病是我國家禽養(yǎng)殖重要的細菌性疾病之一，該病的爆發(fā)給家禽生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。白痢沙門氏菌的隱性感染和攜帶狀態(tài)的形成會導致重復發(fā)病進

2、而防治困難。白痢沙門氏菌侵入雞體內(nèi)后，會抑制MHC ClassⅠ以及誘導IL10表達，這一機制是阻斷清除的過程從而導致攜帶狀態(tài)和持續(xù)感染狀態(tài)的原因之一。雞NLRC5分子可能與沙門氏菌清除的分子機理有關(guān)。截止目前雛雞感染白痢沙門氏菌后組織水平的高通量研究尚無報道，其他菌株由于致病性和病理機制的差異僅能提供部分參考，因此有必要專門對雞白痢沙門氏菌感染過程中的表達譜變化進行系統(tǒng)研究，并在此基礎(chǔ)上進一步研究家禽NLRC5及相關(guān)基因的表達規(guī)律以及

3、啟動子缺失對NLRC5表達的影響，從而分析其受調(diào)控的可能機制，以幫助建立家禽的NLRC5調(diào)控的機制模型，更好的理解家禽白痢沙門氏菌隱性感染形成的機制以及細菌性病原清除的機理。研究內(nèi)容和結(jié)果如下。
　　1.第二章第一節(jié)，比較不同沙門氏菌菌種感染導致雛雞的脾臟和盲腸發(fā)生的表達譜變化。通過安捷倫雞全基因組表達譜芯片，分別對7dpi感染了白痢、腸炎還有poly(I∶C)的雛雞脾臟和盲腸進行了表達譜分析，同時檢測IL-1α，IFNγ，IgG

4、和IgM濃度，腸道載菌量和免疫熒光鑒定脾臟載菌量。結(jié)果表明，病原刺激激發(fā)了系統(tǒng)性沙門氏菌感染的主要特征性免疫反應。在白痢沙門氏菌感染組中，脾臟表達譜富集分析結(jié)果顯示，差異表達基因主要富集于淋巴細胞的分化和增殖過程，因而呈現(xiàn)出獲得性免疫的有效激活狀態(tài);其中與Th1淋巴以及NK細胞激活有關(guān)的重要分子諸如IL15，CD28等均呈現(xiàn)下調(diào)，而與B淋巴細胞活化有關(guān)的基因例如IL7呈現(xiàn)上調(diào)。這表明細胞免疫的清除作用一定程度上已經(jīng)受到了抑制，而B細胞所

5、參與的抗體反應被激活。而感染白痢沙門氏菌組的盲腸組織中，下調(diào)基因主要與天然性免疫系統(tǒng)有關(guān)，表明相關(guān)天然性免疫反應或細胞免疫反應活性的減弱，推測可能與抗體的保護作用增強有關(guān)。
　　第二章第二節(jié)，在證實白痢沙門氏菌感染過程在7dpi造成細胞免疫功能衰弱的基礎(chǔ)上，然后利用時間序列表達譜分析白痢沙門氏菌感染雛雞后2小時、4小時、8小時、24小時、3天、5天、7天、12天、21天脾臟組織中重要的分子事件。同時測定體重、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)、

6、胸腺指數(shù)、以及IL-1α、IFNγ、IgG和IgM濃度。通過WGCNA的表型關(guān)聯(lián)分析，以及探針間的共表達特征，韋恩分析等方法挖掘?qū)е码[性感染和攜帶的差異表達基因。時序表達譜的分析初步探明了在白痢沙門氏菌感染的關(guān)鍵時期脾臟組織中表達譜發(fā)生的變化，觀察到了天然免疫到體液免疫發(fā)展變化過程中脾臟組織中重要的分子事件，包括淋巴細胞的激活，增殖和遷移事件;并鑒定出大量關(guān)鍵調(diào)控基因，例如MHC classⅠ B-F，ANXA13，IL18，BF2，T

7、NFRSF13B，BLB2以及CD28等;富集通路中的基因呈現(xiàn)兩類高度負相關(guān)的功能團;差異表達基因中的節(jié)點基因的表達模式與脾臟指數(shù)高度正相關(guān);在不同階段中免疫反應有關(guān)的通路表現(xiàn)出與其他信號通路和代謝通路不同的關(guān)聯(lián)特征;差異表達基因大多數(shù)均可以定位在有報道的與家禽抗體滴度有關(guān)的QTL區(qū)域內(nèi);NLRC5是差異表達基因;3dpi-5dpi是天然性免疫抑制和細胞免疫激活的關(guān)鍵階段，也是病原清除的主要時期，該階段的差異表達基因表達趨勢反應了雛雞對

8、病原做出免疫反應的特征;NLRC5的表達模式表明NLRC5的翻譯和激發(fā)的下游通路促進了細胞免疫反應和病原的清除作用，但同時可能也受到了負調(diào)控因素的調(diào)控。
　　第二章第三節(jié)，進而基于上述試驗提供的表達譜芯片數(shù)據(jù)，以及NLRC5對MHCI已知的調(diào)控作用的假設(shè)，開展針對NLRC5在表達譜數(shù)據(jù)中的共表達分析，嘗試找到重要的共表達分子。共表達分析結(jié)果顯示，NLRC5與TAP1和IL21R高度共表達，其中作為MHCI區(qū)域中的分子TAP1可能在

9、受到NF-κB調(diào)控的同時也受到NLRC5的影響。
　　2.第三章第一節(jié)，鑒于NLRC5基因功能的重要性及其在雞白痢沙門氏菌感染過程中的表達與調(diào)控功能，本研究進一步對雞NLRC5基因功能進行研究。首先，克隆了雞NLRC5的全長CDS以及UTR序列，并對其進行細致的生物信息學分析。在組織水平對有報道可能與NLRC5功能相關(guān)的基因進行熒光定量的檢測和分析。
　　第三章第二節(jié)，隨后基于克隆的片段構(gòu)建過表達和干擾載體，轉(zhuǎn)染DF1細胞系

10、，并構(gòu)建穩(wěn)定表達株。在此基礎(chǔ)上首先進行細胞免疫熒光鑒定，然后對細胞進行了LPS刺激，以觀察相關(guān)基因表達變化的趨勢。最后在穩(wěn)定表達細胞株上對NLRC5以及信號通路中的關(guān)鍵基因的表達模式進行了比較和分析，并提出了NLRC5及重要相關(guān)基因的假設(shè)調(diào)控機制。NLRC5克隆和分析結(jié)果顯示，雞NLRC5與哺乳動物NLRC5基因具有一定的同源性，推測可能和哺乳動物該基因功能一致，可以進入核內(nèi)發(fā)揮作用，并受到表觀遺傳修飾的影響。NLRC5及其信號通路中的

11、關(guān)鍵基因在組織和細胞中的表達研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB2與NLRC5有顯著的線性共表達關(guān)系，雞的STAT1與NLRC5沒有明顯的共表達特征，推測可能對NLRC5的調(diào)控作用較復雜或可能沒有調(diào)控作用，而STAT3可能作為NF-κB2的負調(diào)控因子負反饋調(diào)控了NLRC5的表達。綜上，除MHCⅠ外，NLRC5可能調(diào)控了STAT3和IL18的轉(zhuǎn)錄表達。家禽NLRC5可能具有與哺乳動物不同的表達調(diào)控機制。
　　3.第四章，為進一步弄清NLRC5受到調(diào)

12、控的具體過程，以及進一步證明雞NLRC5對MHCI的調(diào)控作用，進而幫助更好的開展SPI-2Ⅲ型分泌系統(tǒng)對隱性感染和攜菌狀態(tài)形成作用的研究奠定基礎(chǔ)，本研究初步探索了NLRC5起始密碼子前4372bp區(qū)域不同片段的活性，并分析其潛在的可能調(diào)控原理。NLRC5的系列缺失結(jié)果證明，NLRC5可能具有2個有活性的啟動子區(qū)域，并且通過617到1448之間的區(qū)域隔離兩個啟動子的活性;第二個啟動子活性要強于第一個啟動子活性，并且在該區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了NF-κ

13、B等有報道與NLRC5表達調(diào)控有密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序，1448到4372的片段可能是脾臟組織中的發(fā)揮作用的主要啟動子，轉(zhuǎn)錄表達主要從2108開始的NLRC5分子片段;下游調(diào)控可能較為復雜并且下游元件對NLRC5的表達有顯著的影響;1-2108的活性僅為1448-4372的50％左右，這表明1448-2108的活性要比1828到2108的活性低，因而推測，1828到2213的活性會進一步增強，甚至超過1448到4372的活性，因此

14、認為NLRC5的核心啟動子主要為1828到2213的片段，該區(qū)間包含的元件可能有STAT1、NF-κB、P300、MRF2、FAC1、PAX5、CREB、CPBP、NF-AT1、MRF-2、AML1、FAC1、CRX、RelA-p65。其中STAT1和NF-κB均于轉(zhuǎn)錄起始位點前182bp起始的位置被鑒定出來。
　　未來，研究需確認家禽NLRC5對MHCI調(diào)控的機制，通過更進一步的ChIP，乃至ChIP-Seq對NLRC5結(jié)合啟動