泥鰍多糖的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用機理.pdf

1、泥鰍（MisgurnusangillicaudatusCantor）是我國重要的名優(yōu)經(jīng)濟魚類，屬鰍科動物，全體和皮膚分泌的滑液可以入藥，其藥用功效收載于《中藥大詞典》。其主要功效為補脾益氣、消熱解毒、消痞散結(jié)、祛濕邪、治消渴、水腫黃疸、痢疾、陽痿等癥。民間常用其粘液治癰腫、中耳炎，用活泥鰍搗碎外敷治療乳癌、骨髓炎等。近代用泥鰍散治療傳染性肝炎，效果顯著。我們課題組從泥鰍粘液中分離純化得到一種泥鰍多糖，對它的結(jié)構(gòu)特征、生物活性如抗腫瘤活性

2、、免疫作用等進行了研究，但其機理不清楚。本文在細胞水平上對泥鰍多糖的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用的機理進行了研究。主要結(jié)果如下：1）從小鼠中分離得到脾臟淋巴細胞和腹腔巨噬細胞，研究了泥鰍多糖對小鼠淋巴細胞和巨噬細胞增殖活性的影響，研究發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖可以促進小鼠脾臟淋巴細胞和巨噬細胞的增殖，同時發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖的最佳作用劑量為30μg/ml。進一步對脾臟淋巴細胞的T淋巴細胞群和B淋巴細胞群研究發(fā)現(xiàn)，泥鰍多糖促進T淋巴細胞群的增殖，而對B淋巴細胞群幾乎沒

3、有影響。應用RT－PCR技術進一步研究了泥鰍多糖對T淋巴細胞分泌的細胞因子IL－2、IL－4、IL－6和IFN－γ的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖作用的靶細胞中主要是T細胞的Th1細胞亞群。泥鰍多糖可以提高巨噬細胞分泌的細胞因子IL－6和TNF－α的表達水平，促進iNOS的mRNA表達水平，提高的iNOS進而誘導細胞產(chǎn)生NO。這些結(jié)果說明泥鰍多糖能提高免疫細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，并且作用的靶細胞是T淋巴細胞和巨噬細胞，而對B淋巴細胞沒有影響。2）為

4、了研究泥鰍多糖的抗腫瘤活性，研究了泥鰍多糖對兩種腫瘤細胞株人早幼粒性白血病細胞株HL－60和人肝癌細胞株SMMC－7721的作用。應用MTT法及檢測乳酸脫氫酶漏出率的方法研究泥鰍多糖對腫瘤細胞增殖活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖可以抑制腫瘤細胞HL－60和SMMC－7721細胞的增殖。細胞形態(tài)學觀測泥鰍多糖可以誘導細胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學特征，提取泥鰍多糖處理的細胞DNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)DNA出現(xiàn)DANLadder，流式細胞術檢測

5、發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖可以誘導腫瘤細胞出現(xiàn)亞二倍體的凋亡峰，并且呈現(xiàn)出一定的濃度和時間依賴關系。這些結(jié)果說明泥鰍多糖可以誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，泥鰍多糖抑制腫瘤細胞的增殖主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡所導致的。3）為了確定泥鰍多糖誘導腫瘤細胞的凋亡機理，以人肝癌細胞SMMC－7721為對象，研究了泥鰍多糖對細胞線粒體的作用。先后應用DCFH－DA熒光探針檢測泥鰍多糖對細胞活性氧的產(chǎn)生，應用鈣離子熒光探針Fura－2/AM檢測泥鰍多糖處理的細胞內(nèi)游離鈣離

6、子濃度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖可以增加細胞內(nèi)活性氧的水平，增加細胞內(nèi)游離鈣離子濃度，并且鈣離子濃度的增加是由于胞內(nèi)鈣庫釋放的。應用Rh－123作為熒光染料，檢測線粒體的跨膜電位變化，發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖可以降低線粒體的跨膜電位，這些結(jié)果說明泥鰍多糖誘發(fā)腫瘤細胞的凋亡與其作用于細胞的線粒體，誘發(fā)胞內(nèi)ROS的升高，促發(fā)細胞內(nèi)鈣庫鈣離子的釋放，增加胞內(nèi)鈣離子濃度有關。4）應用RT－PCR的方法研究了泥鰍多糖處理的細胞中與凋亡密切相關的基因p53、Bc

7、l－2、Bax、Fas和Fasl的mRNA的表達水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：泥鰍多糖可以提高p53和Bax基因的mRNA表達水平，降低Bcl－2的mRNA的表達水平，幾乎不影響Fas和Fasl的mRNA的表達水平。這些結(jié)果結(jié)合泥鰍多糖對細胞線粒體的作用說明泥鰍多糖誘導SMMC－7721細胞的凋亡主要是通過線粒體途徑實現(xiàn)的，與死亡受體（DR）途徑無關。5）研究了泥鰍多糖對SMMC－7721細胞NOS的活性、iNOS蛋白的表達水平以及胞內(nèi)和胞外N