微生物大小的測(cè)定及顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名年級(jí)班級(jí)組別一組同組者科目微生物題目微生物大小和數(shù)量的測(cè)定儀器編號(hào)一、目的要求目的要求1學(xué)習(xí)并掌握使用顯微鏡測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法。2了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造、明確其計(jì)數(shù)原理。3學(xué)習(xí)并掌握使用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物細(xì)胞或孢子數(shù)量的方法。二、基本原理基本原理l顯微測(cè)微尺可用于測(cè)量微生物細(xì)胞或孢子的大小，包括鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺兩個(gè)部件。鏡臺(tái)測(cè)微尺全長(zhǎng)1mm，等分為100格，每格0.01mm。用于校正目鏡測(cè)微尺沒(méi)小哥的長(zhǎng)

2、度.目鏡測(cè)微尺其中央刻有50等分或100等分的小格.測(cè)量前應(yīng)預(yù)先用鏡臺(tái)測(cè)微尺來(lái)校正并計(jì)算出在某一放大鏡下目鏡測(cè)微尺每小格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度再以后作為測(cè)量微生物細(xì)胞的長(zhǎng)度.目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度（μm）=（兩重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)x10）兩重合線間目鏡測(cè)微尺格數(shù)2.球菌用直徑表示大?。粭U菌用寬和長(zhǎng)來(lái)表示μm圖一：測(cè)微尺的校正3顯微直接計(jì)數(shù)法：將小量待測(cè)樣品懸浮液置于計(jì)菌器上，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含

3、單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫霍澤（PetrofHausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板或Hawksley計(jì)數(shù)板。三種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間較寬的平臺(tái)，被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)

4、區(qū)。計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)區(qū)（大方格）分為16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。計(jì)數(shù)區(qū)由400個(gè)小方格組成。每個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，其面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋載玻片間的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，通常測(cè)定五個(gè)中方格的微生物數(shù)量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一個(gè)大方格的總菌數(shù)，然后再換算成1（

5、3）菌體大小的測(cè)定1制作枯草芽孢桿菌的單染色制片洗片→干燥→加熱、固定、干燥→結(jié)晶紫染色2min→自然干燥2制作酵母水浸片玻片中央滴一滴美藍(lán)→接種酵母菌→蓋蓋玻片3將鏡臺(tái)測(cè)微尺取下，換上細(xì)菌制片，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量菌體的大小。先量出菌體的長(zhǎng)和寬占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，再以目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度計(jì)算出菌體的長(zhǎng)和寬。同一種群中的不同菌體細(xì)胞之間也存在個(gè)體差異，因此在測(cè)定每一種菌種細(xì)胞大小時(shí)應(yīng)對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行

6、測(cè)量，然后計(jì)算取平均值。2顯微鏡計(jì)數(shù)。（1）血球計(jì)數(shù)板清洗。（2）自然干燥。（3）對(duì)酵母菌液進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂尅Ｈ≡?mL到試管中，用移液管移取9mL水注入試管中。再取上一次稀釋的菌液中的1mL加到另一支試管中，加9mL水。依此類推。即可得到一系列稀釋梯度的菌液。（4）加樣品。血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，將酵母菌懸液搖勻，用無(wú)菌滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一滴，利用表面張力溝槽中流出多余的菌懸液。加樣后靜置5m

7、in，使細(xì)胞或孢子自然沉降。（5）將加有樣品的血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。若發(fā)現(xiàn)菌液太濃，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)有不多于8個(gè)個(gè)菌體。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格（可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。若有菌體位于格線上，則計(jì)數(shù)原則為計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右。如遇酵母出芽，芽體全記或全不計(jì)。（6）清洗。使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板及蓋玻片進(jìn)行清洗、干燥，放回盒

8、中，以備下次使用。5、注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)（1）使用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校正時(shí)，若一時(shí)無(wú)法直接找到測(cè)微尺，可先對(duì)刻尺外的圓圈線進(jìn)行準(zhǔn)焦后再通過(guò)移動(dòng)標(biāo)本推進(jìn)器進(jìn)行尋找。（2）細(xì)菌的個(gè)體微小，在進(jìn)行細(xì)胞大小測(cè)定時(shí)一般應(yīng)選用油鏡，以減小誤差。（3）進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)先在低倍鏡下尋找大方格的位置，找到計(jì)數(shù)室后將其移至視野中央，再換高倍鏡觀察和計(jì)數(shù)。（4）酵母菌計(jì)數(shù)加樣品前，一定將菌液搖勻。（5）為了確定稀釋梯度，可以先將酵母菌的原液加到計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。六、