儀器分析課程設(shè)計(jì)--- 高效液相色譜

1、<p><b>　　高效液相色譜</b></p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　高效液相色譜法又稱(chēng)“高壓液相色譜”“高速液相色譜”“高分離度液相色譜” “近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)。</p><p>　　高效液相色譜用高壓輸液泵將具

2、有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入待測(cè)樣品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。這種方法已成為化學(xué)、生化、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)，是分析化學(xué)、生物化學(xué)和環(huán)境化學(xué)工作者手中必不可少的工具。</p><p>　　關(guān)鍵詞： 液相色譜 高效液相色譜 色譜法 流動(dòng)

3、相</p><p>　　High-performance liquid chromatography</p><p>　　Abstract： High-performance liquid chromatography, also known as "high-pressure liquid chromatography," "high-speed liqui

4、d chromatography," "high-resolution liquid chromatography," "Modern chromatography" and so on. HPLC chromatography is an important branch of the liquid as the mobile phase, high pressure infusion

5、 system. High-performance liquid chromatography with high-pressure infusion pump with a single solvent or a different polarity, different combinations of solvents, buffers and other mob</p><p>　　Key words： L

6、iquid chromatography HPLC Chromatography Mobile phase</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　第一章 概述</b></p><p>　　以高壓液體為流動(dòng)相的液相色譜分析法稱(chēng)高效液相色譜法（HPLC）。其基本方法是用高壓泵將具有一

7、定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑泵入裝有填充劑的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入的樣品被流動(dòng)相帶入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離后依次進(jìn)入檢測(cè)器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色信號(hào)或進(jìn)行數(shù)據(jù)處理而得到分析結(jié)果。</p><p>　　由于高效液相色譜法具有分離效能高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、適用范圍廣（樣品不需氣化，只需制成溶液即可）、色譜柱可反復(fù)使用的特點(diǎn)，在《中國(guó)藥典》中有50種中成藥的定量分析采用該法，已成為中藥制劑

8、含量測(cè)定最常用的分析方法。</p><p>　　高效液相色譜法按固定相不同可分為液-液色譜法和液-固色譜法；按色譜原理不同可分為分配色譜法（液-液色譜）和吸附色譜法（液-固色譜）等。</p><p>　　目前，化學(xué)鍵合相色譜應(yīng)用最為廣泛，它是在液－液色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上，形成的固定相稱(chēng)為化學(xué)鍵合相，不易流失是其特點(diǎn)，一般認(rèn)為有分配與吸附兩種功能，常以分配作

9、用為主。C18（ODS）為最常使用的化學(xué)鍵合相。</p><p>　　根據(jù)固定相與流動(dòng)相極性的不同，液-液色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法，當(dāng)流動(dòng)相的極性小于固定相的極性時(shí)稱(chēng)正相色譜法，主要用于極性物質(zhì)的分離分析；當(dāng)流動(dòng)相的極性大于固定相的極性時(shí)稱(chēng)反相色譜法，主要用于非極性物質(zhì)或中等極性物質(zhì)的分離分析。</p><p>　　1.1高效液相色譜的發(fā)展歷史</p><p

10、>　　色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。液相色譜法開(kāi)始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱(chēng)為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)（常有幾個(gè)小時(shí)）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是

11、在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱(chēng)高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱(chēng)為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱(chēng)現(xiàn)代液相色譜。</p>&l

12、t;p>　　1906年俄國(guó)植物化學(xué)家茨維特首次提出“色譜法”和“色譜圖”的概念。他在論文中寫(xiě)到： “植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結(jié)果按照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀(guān)察到它們相應(yīng)的色帶，就象光譜一樣，稱(chēng)之為色譜圖?！?lt;/p><p>　　1930年以后，相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術(shù)。</p><p>

13、;　　1952年，英國(guó)學(xué)者M(jìn)artin和Synge 基于他們?cè)诜峙渖V方面的研究工作，提出了關(guān)于氣－液分配色譜的比較完整的理論和方法，把色譜技術(shù)向前推進(jìn)了一大步，這是氣相色譜在此后的十多年間發(fā)展十分迅速的原因。</p><p>　　1958年，基于Moore和Stein的工作，離子交換色譜的儀器化導(dǎo)致了氨基酸分析儀的出現(xiàn)，這是近代液相色譜的一個(gè)重要嘗試，但分離效率尚不理想。</p><p>

14、;　　1960年中后期，氣相色譜理論和實(shí)踐的發(fā)展，以及機(jī)械、光學(xué)、電子等技術(shù)上的進(jìn)步，液相色譜又開(kāi)始活躍。到60年代末期把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC。</p><p>　　1970年中期以后，微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜，進(jìn)一步提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度。</p><p>　　1990年以后，生物工程和生命科學(xué)在國(guó)際和國(guó)內(nèi)的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、

15、更新的分離、純化、制備的課題，如人類(lèi)基因組計(jì)劃，蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)分離等。</p><p>　　1.2高效液相色譜特點(diǎn)</p><p>　　高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)是：檢測(cè)的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。適用于分析高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。其缺點(diǎn)是：價(jià)格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無(wú)機(jī)離子困難，流動(dòng)相消耗大且有毒性的居多

16、。</p><p>　?、俑邏海毫鲃?dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。</p><p>　?、诟咝В悍蛛x效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。</p><p>　?、鄹哽`敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在uL數(shù)量。</p><p>　　

17、④應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。</p><p>　?、莘治鏊俣瓤?、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。</p><p>　　此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與

18、氣相色譜相比各有所長(zhǎng)，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜。</p><p>　　1.3高效液相色譜的基本概念和術(shù)語(yǔ)</p><p><b>　　1．色譜圖和

19、峰參數(shù)</b></p><p>　　色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線(xiàn)，又稱(chēng)色譜流出曲線(xiàn)(elution profile)。</p><p>　　基線(xiàn)(base line)——經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線(xiàn)。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。</p><p>　　噪音(noise)——

20、基線(xiàn)信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過(guò)載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。</p><p>　　漂移(drift)——基線(xiàn)隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來(lái)也會(huì)產(chǎn)生漂移。</p><p>　　色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線(xiàn)。流出曲線(xiàn)上的突起部分。正常色譜峰近似于對(duì)

21、稱(chēng)形正態(tài)分布曲線(xiàn)（高斯Gauss曲線(xiàn)）。不對(duì)稱(chēng)色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見(jiàn)。拖尾因子(tailing factor，T)——用以衡量色譜峰的對(duì)稱(chēng)性。也稱(chēng)為對(duì)稱(chēng)因子(symmetry factor)或不對(duì)稱(chēng)因子(asymmetry factor)。峰底—基線(xiàn)上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。</p><p>　　峰高(peak height，h)—峰的最高點(diǎn)

22、至峰底的距離。</p><p>　　峰寬（peak width，W)—峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線(xiàn)與基線(xiàn)的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W＝4σ</p><p>　　半峰寬（peak width at half-height，Wh/2)—峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ</p><p>　　標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，σ)—正態(tài)分布曲線(xiàn)x＝±1

23、時(shí)（拐點(diǎn)）的峰寬之半。正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說(shuō)明組分在流出色譜柱過(guò)程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。</p><p>　　峰面積(peak area，A)—峰與峰底所包圍的面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h</p><p>　　2．定性參數(shù)（保留值）</p&

24、gt;<p>　　死時(shí)間(dead time，t0)——不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過(guò)色譜柱的時(shí)間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來(lái)測(cè)定死時(shí)間。</p><p>　　死體積(dead volume，V0)——由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色

25、譜平衡過(guò)程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）</p><p>　　保留時(shí)間(retention time，tR)——從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。</p><p>　　保留體積(retention volume，VR)——從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。又稱(chēng)洗脫體積。VR＝F

26、15;tR</p><p>　　調(diào)整保留時(shí)間(adjusted retention time，t'R)——扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。也稱(chēng)折合保留時(shí)間(reduced retention time)。在實(shí)驗(yàn)條件（溫度、固定相等）一定時(shí)，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0</p><p><b>　　3．柱效參

27、數(shù)</b></p><p>　　理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡(jiǎn)稱(chēng)柱效）。</p><p>　　N取決于固定相的種類(lèi)、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長(zhǎng)、流動(dòng)相的種類(lèi)和流速及測(cè)定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。</p><p>　　N為常量時(shí)，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果

28、各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。</p><p>　　用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測(cè)定，尤其是對(duì)稍有拖尾的峰。</p><p>　　N與柱長(zhǎng)成正比，柱越長(zhǎng)，N越大。用N表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長(zhǎng)，如果未注明，則表示柱長(zhǎng)為1米時(shí)的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）</p><p>　　理

29、論塔板高度(theoretical plate height，H)——每單位柱長(zhǎng)的方差。</p><p><b>　　4．相平衡參數(shù)</b></p><p>　　分配系數(shù)(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。</p><p>　　分配系數(shù)與組分、流動(dòng)

30、相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱(chēng)交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來(lái)表示。</p><p>　　在條件(流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(shí)(Cs、Cm很小)時(shí)，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無(wú)關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情

31、況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。</p><p>　　在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。<

32、;/p><p>　　在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的。</p><p>　　容量因子(capacity factor，k)——化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的量之比。</p><p>　　選擇性因子(selectivity fact

33、or，α)——相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。</p><p>　　要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無(wú)關(guān)。從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。</p><p><b>　　5．分離參數(shù)</b></p><p>

34、;　　分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當(dāng)W1＝W2時(shí)，R＝。當(dāng)R＝1時(shí)，稱(chēng)為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R＝1.5時(shí)，稱(chēng)為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱(chēng)為完全分離。</p><p>　　從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長(zhǎng)，但這樣會(huì)

35、延長(zhǎng)保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當(dāng)α＝1時(shí)，R＝0，無(wú)論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來(lái)改變選擇性：a. 改變流動(dòng)相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃印＿@常常是提高分離度的最容易方法，可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來(lái)實(shí)現(xiàn)。k2趨于0時(shí)，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時(shí)間延長(zhǎng)，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測(cè)靈敏度。一般k2

36、在1~10范圍內(nèi)，最好為2~5，窄徑柱可更小些。</p><p>　　第二章 高效液相色譜基本理論</p><p>　　2.1高效液相色譜的分類(lèi)</p><p>　　根據(jù)分離原理的不同，可分為：</p><p>　　（一）液－液分配色譜法</p><p>　　流動(dòng)相和固定相都是液體。試樣溶于流動(dòng)相后，在色譜柱內(nèi)經(jīng)過(guò)分界

37、面進(jìn)入固定液（固定相）中，由于試樣組分在固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)溶解度存在差異，因而溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。跟氣一液分配色譜有相似之處：分離順序決定于分配系數(shù)的大小，分配系數(shù)大的組分保留值大。分配系數(shù)為溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的濃度之比。但是氣相色譜法中流動(dòng)相的性質(zhì)對(duì)分配系數(shù)影響大小，而液相色譜中流動(dòng)相的種類(lèi)對(duì)分配系數(shù)卻有較大的影響。</p><p><b>　　（二）吸附色譜法</b><

38、/p><p>　　流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來(lái)進(jìn)行分離的。溶質(zhì)分子被固定相吸附，將取代固定相表面上的溶劑分子。如果溶劑分子吸附性更強(qiáng)，則被吸附的溶質(zhì)分子將相應(yīng)地減少。吸附性大的溶質(zhì)就會(huì)最后流出。</p><p>　　液一固色譜適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性樣品，對(duì)具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高的選擇性。凡能用薄層色譜成功地進(jìn)行分離的化合物，亦可用液一固色

39、譜進(jìn)行分離。缺點(diǎn)是由于非線(xiàn)性等溫吸附常引起峰的拖尾現(xiàn)象。</p><p>　?。ㄈ╇x子交換色譜法</p><p>　　離子交換色譜法是基于離子交換樹(shù)脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子對(duì)交換劑具有不同的親和力而將它們分離的一種方法。</p><p>　　離子交換色譜主要用來(lái)分離離子或可離解的化合物，它不僅用于無(wú)機(jī)離子的分離，例

40、如稀土化合物及各種裂變產(chǎn)物，還用于有機(jī)物的分離。20世紀(jì)60年代前后，已成功地分離了氨基酸、 核酸、蛋白質(zhì)等，在生物化學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。</p><p><b>　　〔四）離子對(duì)色譜法</b></p><p>　　離子對(duì)色譜法是將一種（或多種）與溶劑分子電荷相反的離子（稱(chēng)為對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)化合物，從而控制溶質(zhì)離子

41、的保留行為。</p><p>　　離子對(duì)色譜，特別是反相離子對(duì)色譜解決了以往難分離混合物的分離問(wèn)題，諸如酸、堿和離子和非離子的混合物，特別對(duì)一些生化樣品如核酸、核苷、兒茶酚胺、生物堿以及藥物等的分離。另外還可以借助離子對(duì)的生成給樣品引入紫外吸收或發(fā)熒光的基團(tuán)，以提高檢測(cè)的靈敏度。</p><p><b>　?。ㄎ澹╇x子色譜法</b></p><p&

42、gt;　　離子色譜是目前唯一能獲得快速、靈敏、準(zhǔn)確和多組分分析效果的方法，因而受廣泛重視并得到迅速的發(fā)展。檢測(cè)手段已擴(kuò)展到電導(dǎo)檢測(cè)器之外的其它類(lèi)型的檢測(cè)器，如電化學(xué)檢測(cè)器，紫外光度檢測(cè)器等。可分析的離子正在增多，從無(wú)機(jī)和有機(jī)陰離子至金屬陽(yáng)離子，從有機(jī)陽(yáng)離子到糖類(lèi)、氨基酸等均可用離子色譜法進(jìn)行分析。</p><p><b>　?。┛臻g排阻色譜</b></p><p>

43、;　　空間排阻色譜以凝膠為固定相，它的分離機(jī)理與其它色譜完全不同。它類(lèi)似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來(lái)分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流體力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。</p><p>　　2.2流程與結(jié)構(gòu)組成</p><p><b>　　2.2.1流程</b><

44、;/p><p><b>　　流程</b></p><p>　　流程：如上圖所示，溶劑貯器（1）中的流動(dòng)相被泵（2）吸入，經(jīng)〔3〕梯度控制器按一寫(xiě)的梯度進(jìn)行混后然后輸出，經(jīng)（4）測(cè)其壓力和流量，導(dǎo)入（5進(jìn)樣閥（器）經(jīng)（6）保護(hù)柱、（7）分離柱后到（8）檢測(cè)器檢測(cè)，由（10）數(shù)據(jù)處理設(shè)備處理數(shù)據(jù)或（11）記錄儀記錄色譜圖，（12）餾分收集器收集餾分，（13）為廢液。 <

45、/p><p><b>　　2.2.2結(jié)構(gòu)組成</b></p><p>　　高效液相色譜儀可分為以下幾個(gè)部分：</p><p><b>　　1.高壓輸液泵：</b></p><p>　?。?）功能：驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相和樣品通過(guò)色譜分離柱和檢測(cè)系統(tǒng)；</p><p>　?。?）性能要求：流量

46、穩(wěn)定（±1?），耐高壓（30－60Mpa），耐各種流動(dòng)相：例如：有機(jī)溶劑、水和緩沖液；</p><p>　?。?）種類(lèi)：往復(fù)泵和隔膜泵。</p><p><b>　　2.色譜柱</b></p><p>　?。?）功能：分離樣品中的各個(gè)物質(zhì)；</p><p>　?。?）尺寸：10～30cm長(zhǎng)，2～5mm內(nèi)經(jīng)的內(nèi)壁

47、拋光的不銹鋼管柱；</p><p>　　（3）填料粒度：5～10µm，高效微粒固定相；</p><p><b>　　3.進(jìn)樣器</b></p><p>　?。?）功能：將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)；</p><p>　　（2）種類(lèi)：①注射器，10Mpa以下，1～10µl微量注射器進(jìn)樣；②停流進(jìn)樣；③閥進(jìn)樣

48、，常用、較</p><p>　　理想、體積可變，可固定；④自動(dòng)進(jìn)樣器，有利于重復(fù)操作，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。</p><p><b>　　4.檢測(cè)器</b></p><p>　?。?）功能：將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號(hào)；（2）分類(lèi)：①示差折光化學(xué)檢測(cè)器</p><p><b>　?、谧贤馕諜z測(cè)

49、器 </b></p><p>　?、圩贤庖豢赏止夤舛葯z測(cè)器</p><p>　?、芏O管陣列紫外檢測(cè)器</p><p><b>　?、轃晒鈾z測(cè)器</b></p><p><b>　　⑥電化學(xué)檢測(cè)器</b></p><p><b>　　5.餾分收集器&l

50、t;/b></p><p>　?。?）功能：如果所進(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其它波譜鑒定，或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備，餾分收集是必要的；</p><p>　　（2）方法：①手工，少數(shù)幾個(gè)餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯(cuò)。②餾分收集器收集，比較理想，微機(jī)控制操作準(zhǔn)確。</p><p>　　6.數(shù)據(jù)獲取和處理系統(tǒng)</p><p&

51、gt;　　功能：把檢測(cè)器檢測(cè)到的信號(hào)顯示出來(lái)。</p><p><b>　　2.3使用方法</b></p><p><b>　　2.3.1綜述</b></p><p>　　色譜柱的填料和流動(dòng)相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵

52、合硅膠也有使用；離子交換填料,用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器。 </p><p>　　在用紫外吸收檢測(cè)器時(shí),所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外分光光度法項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求。 </p><p>　　1.正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類(lèi)、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類(lèi)型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、

53、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變,以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。 </p><p>　　2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。按各品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整,應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子。 </p><p>　　2.3

54、.2色譜柱的理論板數(shù)</p><p>　　在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n＝5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)，如果測(cè)得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長(zhǎng)、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。 </p>&l

55、t;p><b>　　2.3.3分離度</b></p><p>　　定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測(cè)量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計(jì)算公式為：　2[t(R2)-t(R1)] ，R＝ -W1＋W2 式中 t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。</

56、p><p><b>　　2.3.4拖尾因子</b></p><p>　　為保證測(cè)量精度，特別當(dāng)采用峰高法測(cè)量時(shí)，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定,或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為： </p><p>　　W(0.05h) T＝-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬； </p>

57、;<p>　　d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95～1.05間。</p><p>　　也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80％、100％和120％的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計(jì)算平均校正因子，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0％。 </p><p><b>　　2.4 測(cè)定方法</b>

58、;</p><p>　　定量測(cè)定時(shí)，可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內(nèi)標(biāo)法測(cè)定雜質(zhì)總量時(shí)，須采用峰面積法。 </p><p>　　2.4.1面積歸一化法</p><p>　　測(cè)定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計(jì)算各雜質(zhì)峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計(jì)算在內(nèi)。色譜圖的

59、記錄時(shí)間應(yīng)根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保留時(shí)間決定，除另有規(guī)定外,可為該品種項(xiàng)下主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。 </p><p>　　2.4.2主成分自身對(duì)照法</p><p>　　當(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時(shí)，采用主成分自身對(duì)照法。在測(cè)定前，先按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對(duì)照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度或進(jìn)樣量，使對(duì)照溶液中的主成分色譜峰面積滿(mǎn)足準(zhǔn)確測(cè)量要求。然后

60、取供試品溶液，進(jìn)樣，記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。根據(jù)測(cè)得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)限度。 </p><p><b>　　2.4.3內(nèi)標(biāo)法</b></p><p>　　測(cè)定供試品中雜質(zhì)的總量限度 </p><p>　　采用不加校正因子的峰面積法。取供試品，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法

61、配制不含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖Ｉ；再配制含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖Ⅱ。記錄的時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為該品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間的倍數(shù)，色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰高應(yīng)為記錄儀滿(mǎn)標(biāo)度的30％以上，否則應(yīng)調(diào)整注樣量或檢測(cè)器靈敏度。 </p><p>　　如果色譜圖Ⅰ中沒(méi)有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，則色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰面積之和應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積（溶劑峰不計(jì)在內(nèi)）。如

62、果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，應(yīng)將色譜圖Ⅱ上的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質(zhì)峰面積，即為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積；色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積，即為各雜質(zhì)峰的校正總面積，各雜質(zhì)峰的校正總面積應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積。 </p><p>　　加校正因子測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量 </p><p>　　按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,精密稱(chēng)（量）取對(duì)照

63、品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子： </p><p>　　As／ms]校正因子f＝- Ar／mr 式中 As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，Ar為對(duì)照品的峰面積或峰高； ms為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量,mr為加入對(duì)照品的量。 再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量供試品（或其

64、雜質(zhì)）峰和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：Ax 含量（mx）＝f×-As／ms 式中 Ax為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高； mx為供試品（或其雜質(zhì)）的量。 f、As和ms的意義同上。 </p><p>　　當(dāng)配制校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一份內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí)，則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱(chēng)（量）取。 </p><p><b>　　2.

65、4.4外標(biāo)法</b></p><p>　　測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量 </p><p>　　按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,精密稱(chēng)(量)取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品和供試品待測(cè)成分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量： </p><p>　　A<[x]> 含量（mx）＝mr×-Ar式中各符

66、號(hào)意義同上 </p><p>　　由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時(shí)，以定量環(huán)進(jìn)樣為好。 </p><p><b>　　2.5設(shè)備選型</b></p><p><b>　　2.5.1綜述</b></p><p>　　要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能

67、多的 了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對(duì)分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。 </p><p>　　2.5.2相對(duì)分子質(zhì)量</p><p>　　對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對(duì)分子質(zhì)量在20

68、0 ~ 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對(duì)分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。 </p><p><b>　　2.5.3溶解度</b></p><p>　　水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對(duì)非極性的混合物，可用液-固色譜法。 <

69、/p><p><b>　　2.5.4化學(xué)結(jié)構(gòu)</b></p><p>　　若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機(jī)螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于離子化合物；異構(gòu)體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團(tuán)的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對(duì)于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。

70、</p><p>　　第三章 高效液相色譜儀</p><p>　　HPLC的出現(xiàn)不過(guò)三十多年的時(shí)間，但這種分離分析技術(shù)的發(fā)展十分迅猛，目前應(yīng)用也十分廣泛。其儀器結(jié)構(gòu)和流程也多種多樣。典型的高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)和流程可用下列方框圖表示（See Fig.3-4）。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、恒溫器、記錄儀等主要部件。</p>

71、<p>　　高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛應(yīng)用于核酸、肽類(lèi)、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲(chóng)劑、除莠劑的分析等物質(zhì)的分析。 </p><p><b>　　3.1高壓泵</b></p><p>　　HPLC使用的色譜柱是很細(xì)的（1~6 mm），所用固定相的

72、粒度也非常?。◣爪蘭到幾十μm），所以流動(dòng)相在柱中流動(dòng)受到的阻力很大，在常壓下，流動(dòng)相流速十分緩慢，柱效低且費(fèi)時(shí)。為了達(dá)到快速、高效分離，必須給流動(dòng)相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動(dòng)速度。為此，須用高壓泵進(jìn)行高壓輸液。高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。</p><p>　　HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿(mǎn)足下列條件：</p><p>　　a. 流量恒定，無(wú)脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍（一般為1~

73、10 mL/min）；</p><p>　　b. 能抗溶劑腐蝕；</p><p>　　c. 有較高的輸液壓力；對(duì)一般分離，60×105Pa的壓力就滿(mǎn)足了，對(duì)高效分離，要求達(dá)到150~300×105Pa。</p><p>　　(1). 往復(fù)式柱塞泵</p><p>　　當(dāng)柱塞推入缸體時(shí)，泵頭出口（上部）的單向閥打開(kāi)，同時(shí)，流

74、動(dòng)相進(jìn)入的單向閥（下部）關(guān)閉，這時(shí)就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時(shí)，流動(dòng)相入口的單向閥打開(kāi)，出口的單向閥同時(shí)關(guān)閉，一定量的流動(dòng)相就由其儲(chǔ)液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個(gè)色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動(dòng)相。</p><p><b>　?。?）氣動(dòng)放大泵</b></p><p>　　其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動(dòng)大面積（

75、 SA ）活塞 A ，則在小面積（ SB ）活塞 B 輸出壓力增大至 p2 的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于 A 和 B 兩活塞的面積比，如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 ，則壓力為 5 × Pa 的氣體就可得到壓力為 250×Pa 的輸出液體。這是一種恒壓泵。</p><p><b>　　3.2梯度洗提</b></p><p>　　類(lèi)似于

76、GC中的程序升溫。已成為現(xiàn)代高效液相色譜中部缺少的部分。</p><p>　　梯度洗提，就是載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過(guò)程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過(guò)載液中極性的變化來(lái)改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。梯度洗提可以分為兩種： </p><p>　　a. 低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下，預(yù)先按一定程序?qū)煞N或多種不同極性的溶劑混合后，再用一

77、臺(tái)高壓泵輸入色譜柱。 </p><p>　　b.高壓梯度 ( 或稱(chēng)內(nèi)梯度系統(tǒng) ) ：利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設(shè)定的比例送入梯度混合室，混合后，進(jìn)入色譜柱。 </p><p><b>　　3.3進(jìn)樣裝置</b></p><p>　　(1).注射器進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣所用微量注射器及進(jìn)樣方式與 GC法一樣。進(jìn)樣壓力150×10

78、5Pa時(shí)，必須采用停流進(jìn)樣。</p><p>　　(2).高壓定量進(jìn)樣閥：與GC法用的流通法相似，能在高壓下進(jìn)樣。</p><p><b>　　3.4色譜柱</b></p><p>　　色譜柱是色譜儀最重要的部件（心臟）。通常用后壁玻璃管或內(nèi)壁拋光的不銹鋼管制作的，對(duì)于一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時(shí)，可用銅管、鋁管或聚四氟乙烯管。柱子內(nèi)徑一般

79、為1～6 mm。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為 4.6 或 3.9mm ，長(zhǎng)度為 15 ～ 30cm 的直形不銹鋼柱。填料顆粒度 5 ～ 10μm ，柱效以理論塔板數(shù)計(jì)大約 7000 ～ 10000 。 </p><p>　　發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。 </p><p><b>　　3.5檢測(cè)器</b></p><p>　　(1).紫外光

80、度檢測(cè)器 </p><p>　　它的作用原理是基于被分析試樣組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比爾定律。最常用的檢測(cè)器，應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。</p><p><b>　　特點(diǎn)： </b></p><p>　　a. 靈敏度高：其最小檢測(cè)量10-9g·mL-1，故即使對(duì)紫外光吸收很弱的物質(zhì)，也可以

81、檢測(cè)； </p><p>　　b. 線(xiàn)性范圍寬；(比爾定律) </p><p>　　c. 流通池可做的很?。?mm × 10mm ，容積 8μL）； </p><p>　　d. 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感,可用于梯度洗脫； </p><p>　　e. 波長(zhǎng)可選，易于操作:如，使用裝有流通池的可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)（可變波長(zhǎng)檢測(cè)器）。

82、</p><p>　　缺點(diǎn)：對(duì)紫外光完全不吸收的試樣不能檢測(cè)；同時(shí)溶劑的選擇受到限制。 </p><p>　　(2).光電二極管陣列檢測(cè)器 </p><p>　　紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；陣列由1024個(gè)光電二極管陣列，每個(gè)光電二極管寬僅50μm，各檢測(cè)一窄段波長(zhǎng)。如圖所示，在檢測(cè)器中，光源發(fā)出的紫外或可見(jiàn)光通過(guò)液相色譜流通池，在此流動(dòng)相中的各個(gè)組分進(jìn)行特征吸收，然后通

83、過(guò)狹縫，進(jìn)入單色其進(jìn)行分光，最后由光電二極管陣列檢測(cè)，得到各個(gè)組分的吸收信號(hào)。經(jīng)計(jì)算機(jī)快速處理，得三維立體譜圖。 </p><p>　　(3).熒光檢測(cè)器 </p><p>　　熒光檢測(cè)器是一種高靈敏度、高選擇性檢測(cè)器。 </p><p>　　對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類(lèi)化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)。 </p><p&

84、gt;　　熒光檢測(cè)器的結(jié)構(gòu)及工作原理和熒光光度計(jì)相似。 </p><p>　　(4).差示折光檢測(cè)器　 </p><p>　　除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器。 </p><p>　　差示折光檢測(cè)器是借連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率的方法來(lái)測(cè)定試樣濃度的檢測(cè)器。溶液的折射率是純?nèi)軇鲃?dòng)相）和純?nèi)苜|(zhì)（試樣）折射率乘以各物質(zhì)的濃度之和。因此溶有試樣的流動(dòng)相和純流動(dòng)相之間折

85、射率之差表示試樣在流動(dòng)相中的濃度。 </p><p>　　(5).電導(dǎo)檢測(cè)器 </p><p>　　其作用原理是根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生電導(dǎo)變化來(lái)測(cè)定電離物質(zhì)含量。</p><p>　　第四章 高效液相色譜儀操作注意事項(xiàng)</p><p><b>　　4.1操作注意事項(xiàng)</b></p><p&g

86、t;<b>　　4.1.1流動(dòng)相</b></p><p>　　1、流動(dòng)相應(yīng)選用色譜純?cè)噭?、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過(guò)濾后使用，過(guò)濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；</p><p>　　2、水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換（一般不超過(guò)2天），防止長(zhǎng)菌變質(zhì)；</p><p>　　3、使用雙泵時(shí)，A、B、C、D四相中，若所用流動(dòng)相中有含鹽流動(dòng)相，則

87、A、D（進(jìn)液口位于混合器下方）放置含鹽流動(dòng)相，B、C（進(jìn)液口位于混合器上方）放置不含鹽流動(dòng)相；</p><p>　　A、B、C、D四個(gè)儲(chǔ)液器中其中一個(gè)為棕色瓶，用于存放水相流動(dòng)相。</p><p><b>　　4.1.2樣品</b></p><p>　　1、采用過(guò)濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；</p><p&

88、gt;　　2、用流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱（若為反相柱，則極性比流動(dòng)相大；若為正相柱，則極性比流動(dòng)相?。┑娜軇┲苽錁悠啡芤?，盡量用流動(dòng)相制備樣品液；</p><p>　　手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的3～5倍；</p><p><b>　　4.1.3色譜柱</b></p><p>　　1、使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說(shuō)明

89、書(shū)，注意適用范圍，如pH值范圍、流動(dòng)相類(lèi)型等；</p><p>　　2、使用符合要求的流動(dòng)相；</p><p><b>　　3、使用保護(hù)柱；</b></p><p>　　4、如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。</p><p>　　5、 色譜柱在不使用時(shí)，應(yīng)

90、用甲醇沖洗，取下后緊密封閉兩端保存；</p><p>　　6、 不要高壓沖洗柱子；</p><p>　　7、 不要在高溫下長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱；</p><p>　　使用過(guò)程中注意輕拿輕放。</p><p><b>　　4.2操作過(guò)程</b></p><p><b>　　1、開(kāi)機(jī)操

91、作：</b></p><p>　?。?）打開(kāi)電源，用Harb相連接時(shí)，注意Harb電源，打開(kāi)計(jì)算機(jī)，打開(kāi)Bootp Server；</p><p>　?。?）自上而下打開(kāi)個(gè)組件電源，Bootp Server里顯示有信號(hào)時(shí)（有六行字符），打開(kāi)工作站（先打開(kāi)On line）；</p><p>　?。?）打開(kāi)沖洗泵頭的10％異丙醇溶液的開(kāi)關(guān)（需用針捅抽），控制

92、流量大小，以能流出的最小流量為準(zhǔn)；</p><p>　?。?）注意各流動(dòng)相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于最低限會(huì)自動(dòng)停泵，注意洗泵溶液的體積，及時(shí)加液；</p><p>　?。?）使用過(guò)程中要經(jīng)常觀(guān)察儀器工作狀態(tài)，及時(shí)正確處理各種突發(fā)事件。</p><p>　　2、先以所用流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)一定時(shí)間（如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流

93、動(dòng)相），正式進(jìn)樣分析前30min 左右開(kāi)啟D燈或W燈，以延長(zhǎng)燈的使用壽命；</p><p>　　3、建立色譜操作方法，注意保存為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果；</p><p>　　4、使用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液洗凈進(jìn)樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品液清洗進(jìn)樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡；</p>

94、<p>　　5、溶劑瓶中的沙芯過(guò)濾頭容易破碎，在更換流動(dòng)相時(shí)注意保護(hù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過(guò)濾頭變臟或長(zhǎng)菌時(shí)，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；</p><p>　　6、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個(gè)管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過(guò)程中關(guān)閉D燈、W燈；</p><p>　　7、關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)閉泵、檢測(cè)器等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機(jī)，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組

95、件，關(guān)閉洗泵溶液的開(kāi)關(guān)；</p><p>　　8、使用者須認(rèn)真履行儀器使用登記制度，出現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)向老師報(bào)告，不要擅自拆卸儀器。</p><p>　　第五章 高效液相色譜的應(yīng)用</p><p>　　5.1色譜技術(shù)的聯(lián)用 </p><p>　　色譜是一種很好的分離手段，可以將復(fù)雜的混合物中的各個(gè)組分分離開(kāi)，但它的定性、定結(jié)構(gòu)的能力較差。</

96、p><p>　　定性和定結(jié)構(gòu)的分析手段：質(zhì)譜（MS）、紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）、核磁共振波譜（NMR）、原子吸收光譜（AAS）、等離子發(fā)射光譜（ICP-AES）</p><p>　　早期采用的聯(lián)用手段：將色譜分離后的純物質(zhì)，收集起來(lái)后，經(jīng)過(guò)一些處理，再利用以上手段定性、定結(jié)構(gòu)，這種聯(lián)用稱(chēng)為：脫機(jī)、非在線(xiàn)的聯(lián)用。</p><p>　　多維色譜技術(shù)：某一種色譜分離

97、模式往往很難將一個(gè)復(fù)雜的混合物中的所有組分都很好地分開(kāi)，人們常采用將色譜未能完全分離的樣品收集起來(lái)，再有另一種分離模式的色譜進(jìn)行分離。這是不同模式的色譜的聯(lián)用，這稱(chēng)為多維色譜技術(shù)。</p><p>　　色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：色質(zhì)聯(lián)用現(xiàn)在用得較多，氣質(zhì)聯(lián)用的儀器在國(guó)內(nèi)相當(dāng)多的實(shí)驗(yàn)室都有裝備。</p><p>　　色譜-原子光譜的聯(lián)用：原子光譜是指原子吸收和原子發(fā)射光譜法，這兩種分析方法主要用于金屬

98、或非金屬元素的定性、定量分析。色譜主要是用于有機(jī)化合物的分析、分離和提純。近年來(lái)，有關(guān)色譜和原子光譜聯(lián)用技術(shù)的研究報(bào)道在文獻(xiàn)中大量的出現(xiàn)。帶有火焰光度檢測(cè)器的氣相色譜儀就是最早的氣相色譜-原子光譜聯(lián)用儀器。</p><p>　　色譜-博里葉變換紅外光譜聯(lián)用：紅外光譜在有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)分析中有著很重要的作用。色譜是有機(jī)化合物分離、純化的最好方法。棱鏡或光柵型紅外光譜的掃描速度很慢，靈敏度也低，色譜與紅外光譜在線(xiàn)聯(lián)用

99、時(shí)，往往只能采用停流的方法，這種方法僅適合于氣相色譜和某些正相液相色譜，不適合反相液相色譜。</p><p>　　傅里葉變換紅外光譜出現(xiàn)后，由于掃描速度和靈敏度都有很大提高，解決了色譜和紅外光譜聯(lián)用時(shí)掃描速度慢的最大障礙，使色譜一傅里葉變換紅外光譜聯(lián)用有了很大進(jìn)展。</p><p>　　5.2高壓液相色譜法的應(yīng)用舉例</p><p>　　5.2.1在食品分析中的應(yīng)用

100、 </p><p>　　食品中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：有機(jī)酸、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪等。</p><p>　　食品中的添加劑： 防腐劑、抗氧化劑、人工合成色素、甜味劑、保鮮劑等。</p><p>　　食品中的污染成份：由于環(huán)境污染，使食品沾污有害的微量元素、農(nóng)藥殘留、黃曲霉素等。</p><p>　　近年來(lái)高效液相色譜分析法在食品分析中的應(yīng)用越來(lái)越

101、多，它比化學(xué)分析法的操作簡(jiǎn)便、快速，并能提供更多的有用信息。</p><p><b>　　1、糖類(lèi)的分離分析</b></p><p>　　食品中糖的含量是產(chǎn)品質(zhì)量控制的一個(gè)指標(biāo)。糖類(lèi)可分為單糖、寡糖和多糖。它們可以使用離子交換柱或胺基鍵合相柱進(jìn)行分離。</p><p>　　使用反相鍵合相色譜柱可實(shí)現(xiàn)對(duì)淀粉水解的單糖和麥芽糖的分離。</p&

102、gt;<p>　?。?、有機(jī)酸及酸味劑的分離分析</p><p>　　食品中的有機(jī)酸和酸味劑是食品酸味和鮮味的重要成份，也對(duì)食品的防腐保鮮起作重要作用。</p><p>　　如圖為白葡萄酒中酸味劑的分析譜圖（使用反相鍵合柱，流動(dòng)相為0.0035mol/LH2SO4溶液）</p><p>　　3、維生素的分離分析</p><p>　

103、　人體所需的維生素雖然量不多，但不可缺少。而且大多數(shù)維生素來(lái)自于食品。其種類(lèi)繁多，但結(jié)構(gòu)大相徑庭，可采用反相離子對(duì)色譜柱、反相鍵合色譜柱或胺基鍵合相柱實(shí)現(xiàn)分離分析。</p><p>　　4、食品添加劑的分離分析</p><p>　　食品添加劑是指在食品加工、生產(chǎn)、處理、包裝和保存等過(guò)程中，加入的保持食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、防止腐敗變質(zhì)、增強(qiáng)食品感官性狀，從而提高食品質(zhì)量的化學(xué)合成或天然物質(zhì)。<

104、/p><p>　　食品添加劑 的使用中，明確制定了衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，限定了食品添加劑的種類(lèi)、名稱(chēng)、應(yīng)用范圍、最大作用量和殘留量。</p><p>　　食品添加劑主要有：防腐劑、抗氧化劑、甜（香）味劑、香料和天然或人工合成色素。</p><p>　　5、食品污染物的分析</p><p>　　食品中的有害有毒物質(zhì)來(lái)源通常有兩種途徑，一是由于環(huán)境污染造成的食品

105、污染，另一是在貯存、包裝或加工過(guò)程造成的污染。</p><p>　　例如黃曲霉素的分析。黃曲霉素是一類(lèi)稠環(huán)類(lèi)固醇化合物，有致癌作用，是食品污染物分析的重點(diǎn)。</p><p>　　黃曲霉素可以用正相吸附柱（如花生） ．反相鍵合相柱（如堅(jiān)果．動(dòng)物飼料．牛奶等）色譜分析。</p><p>　　黃曲霉素的分析過(guò)程一般為：</p><p>　　5.2

106、.2在環(huán)境污染分析中的應(yīng)用 </p><p>　　高效液相色譜方法適用于對(duì)環(huán)境中存在的高沸點(diǎn)有機(jī)污染物的分析，如大氣．水土壤和食品中存在的多環(huán)芳烴．多氯聯(lián)苯．有機(jī)氯農(nóng)藥、有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯農(nóng)藥、含氮除草劑、苯氧基酸除草劑、酚類(lèi)、胺類(lèi)、黃曲霉素、亞硝胺等。</p><p><b>　　１、多環(huán)芳烴的檢測(cè)</b></p><p>　　多環(huán)芳烴（

107、ＰＡＨs）存在于工業(yè)和民用燃燒器、自動(dòng)化排煙、煙草煙霧中，因有機(jī)燃料未完全燃燒而產(chǎn)生的，它還存在于礦物燃料、柴油燃料滲漏、雜酚油傾倒和供水管線(xiàn)的瀝青、煤焦油的襯層中。多環(huán)芳烴是可引起癌癥的有毒物質(zhì)，是環(huán)境監(jiān)測(cè)對(duì)象。</p><p><b>　　2、多氮聯(lián)苯的檢測(cè)</b></p><p>　　多氯聯(lián)苯是一種具有高絕緣性能的材料，多用作各種變壓器的絕緣介質(zhì)，在自然界難于降

108、解，所以多存在于土壤、河流底泥中。和多環(huán)芳烴一樣，ＰＣＢ也是一種全球性環(huán)境污染物，通過(guò)自然循環(huán)和食物鏈的富集機(jī)制，ＰＣＢ廣泛積蓄于各種生物體中，其對(duì)人類(lèi)的主要危害是會(huì)引起癌變或畸變。</p><p><b>　　3、農(nóng)藥殘留的檢測(cè)</b></p><p>　　農(nóng)藥可分為殺菌劑、除草劑和殺蟲(chóng)劑。由化學(xué)組成可分為有機(jī)氯農(nóng)藥、有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯、含氮除草劑、苯氧羧酸除草

109、劑等。各種農(nóng)藥使用后殘留存在于土壤、水、植物體中，對(duì)不易降解的農(nóng)藥，經(jīng)食物鏈會(huì)在人體中聚集，從而造成對(duì)人體健康的危害。 </p><p>　　我們知道，有機(jī)氯農(nóng)藥在２０世紀(jì)５０～６０年代的廣泛使用已造成對(duì)人類(lèi)居住環(huán)境的嚴(yán)重危害，現(xiàn)已禁用。</p><p>　　對(duì)不同的農(nóng)藥所使用的色譜柱和流動(dòng)相差異較大，實(shí)驗(yàn)條件也各不相同。</p><p>　　5.2.3其它

110、方面的應(yīng)用 </p><p>　?。?、在生物化學(xué)和生物工程中的應(yīng)用</p><p>　　隨著生命科學(xué)和生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，人們對(duì)氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)及核堿、核苷、核苷酸、核酸等生物分子的研究興趣日益增加。這些生物活性分子是人類(lèi)生命延續(xù)過(guò)程必須攝取的成份，也是生物化學(xué)、生化制劑、生物工程中進(jìn)行蛋白質(zhì)純化、ＤＮＡ重組與修復(fù)等技術(shù)中的很需要研究對(duì)象，因此涉及它們的分離、分析問(wèn)題也日益很重要。

111、</p><p>　　高效液相色譜中的反相色譜法、體積排阻色譜法、親和色譜法和離子色譜法都可用于以上多種生物分子的分離和分析。</p><p>　　2、在醫(yī)藥研究中的應(yīng)用</p><p>　　如：人工合成藥物的純化及成份定性、定量測(cè)定，中草藥有效成份的分離、制備及純度測(cè)定等。</p><p>　　另外，臨床醫(yī)藥研究人體血液和體液中藥物濃度藥物

112、代謝的測(cè)定等。</p><p>　　３、在精細(xì)化工分析中的應(yīng)用</p><p>　　在精細(xì)化工生產(chǎn)中使用的具有較高分子量和較高沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，如高碳婁脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各種表面活性劑、藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品，都可用高效液相色譜法進(jìn)行分析。</p><p><b>　　總結(jié)</b></p>