質粒提取常見問題與解析

1、質粒提取常見問題與解析質粒提取常見問題與解析1.溶液I―溶菌液:溶菌酶:它是糖苷水解酶能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β14糖苷鍵因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖:增加溶液的粘度維持滲透壓防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA:(1)螯合Mg2、Ca2等金屬離子抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基)(2)EDTA的存在有利于溶菌酶的作用因為溶菌酶的反

2、應要求有較低的離子強度的環(huán)境。2.溶液IINaOHSDS液:NaOH:核酸在pH大于5小于9的溶液中是穩(wěn)定的。但當pH12或pH3時就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1L加抽提液時該系統(tǒng)的pH就高達12.6因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。SDS:SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有:(1)溶解細胞膜上的脂質與蛋白因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。(2)解聚細胞中的核蛋白。(3)SDS能與蛋白質結

3、合成為ROSO3…R蛋白質的復合物程度的溶解因而DNA損失也增大尤其用多次乙醇沉淀時就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙酵最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置1530分鐘即可。5.在用乙醇沉淀DNA時為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.1~0.25molL在pH為8左右的溶液中DNA分子是帶負電荷的加一定濃度的NaAc或NaCl使Na中和

4、DNA分子上的負電荷減少DNA分子之間的同性電荷相斥力易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀當加入的鹽溶液濃度太低時只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合這樣就造成DNA沉淀不完全當加入的鹽溶液濃度太高時其效果也不好。在沉淀的DNA中由于過多的鹽雜質存在影響DNA的酶切等反應必須要進行洗滌或重沉淀。6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后為什么再要用SDS與KAc來處理加進去的RNase本身是一種蛋白質為了純化DNA又必須去除之加SDS可使它們成為SDS蛋