β內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè)

1、β-內(nèi)酰胺酶的分類及檢測(cè),醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心,表2 β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)和功能分類分子結(jié)構(gòu) 功能 舉例 最適底物 抑制劑(Ambler) (Bush) PEN CARB OX CR CTX ATM IPM CLAV CLOX EDTA絲氨酸酶 A

2、2a PC1，LEN-1 卅 十 － 土 － － － 卄 － － 2b SHV-1,TEM-1 卅 十 十 卄 － － － 卄 － － 2be K1,TEM-3, 卅 十 十 卄 卄

3、 卄 － 卄 － － SHV-2,PER-1 2br TEM-31 卅 十 十 十 － － － － － － 2C PSE-1,BRO-1 卄 卅 十 十 － － －

4、 十 － － 2e 卄 卄 － 卄 卄 卄 － 卄 － － 2f Sme-1,NMC-A 卄 十 ? 十 十 卄 卄 十 － －

5、 IMI-1 C 1 AmpC 卄 十 － 卅 十 － － － 卄 － D 2d OXA-1 卄 十 卅 十 － － － V － － 未定 4

6、 AVS-1 卄 卄 卄 V V － － － － － 金屬酶B 3 IMP-1 卄 卄 卄 卄 卄 － 卄 － － 卄 嗜麥芽L-1,,,,Bush-J-M分類策略

7、 3組金屬酶 頭孢菌素酶 1組 酶EDTA 2e組

8、 2a組 2d組 青霉素 酶

9、 2c 組 2f組 非金屬酶 4 組

10、 2be 組 廣譜酶 2b

11、 2br組,,,,,,,,小結(jié)1組酶：頭孢菌酶 ，優(yōu)先水解底物是頭孢菌素，它們水解青霉素的的速率低于水解頭孢噻啶的速率的30%，對(duì)三代頭孢菌素和頭霉烯耐藥，但對(duì)碳青酶烯和四代頭孢菌素較為敏感，對(duì)酶抑制劑克拉維酸和EDTA均不敏感，可被氯唑西林抑制 2組酶：優(yōu)先水解青霉素類抗生素，其中水解頭孢噻啶的速率低于水解青霉素的速率的30%者為青霉素酶 ，又分為2a、2b、2c、2d、2e和2 f亞組。3組酶：又稱金屬酶，能滅活青霉素類

12、、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗生素，但對(duì)安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制劑克拉維酸和氯唑西林對(duì)它無(wú)作用 。4組酶：是染色體介導(dǎo)的耐抑制劑的青霉素酶，對(duì)頭孢類抗生素的敏感性不定，對(duì)氨曲南和碳青霉烯敏感。,A類β-內(nèi)酰胺酶1。 A類β-內(nèi)酰胺酶： 廣譜酶2b組,,,A,B,A 大腸埃希菌TEM-1型酶結(jié)構(gòu) ；B 肺炎克雷伯菌的SHV-1型酶結(jié)構(gòu),超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(2be) 經(jīng)典超廣譜β-內(nèi)酰胺

13、酶 TEM型ESBLs SHV型ESBLs SHV-2型ESBLs 、SHV-5 型ESBLs SHVΩ環(huán)突變型ESBLs 其他超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 CTX-M-型酶 可為分4個(gè)小組

14、 PER-1及其相關(guān)ESBL PER-1、-2 、VEB-1、2 CME-1 TLA-1 特殊的非典型ESBL SFO-1 、GES-1,,,TEM型ESBLs,1．Glu140→Lys和Glu240→Lys替換 ：對(duì)頭孢他啶和氨曲南 耐藥

15、2．Arg164→Ser或His ：對(duì)頭孢他啶耐藥 ，對(duì)頭孢噻肟敏感 3．Gly238→Ser：主要提高了對(duì)頭孢噻肟的水解能力（如TEM-19 ),,SHV型ESBLs,,1. SHV-2型ESBLs： Gly238→Ser，主要提高水解頭孢噻肟的能力2. SHV-5型ESBLs ：同時(shí)具有Gly238→Ser和Glu240→Lys突變3. SHVΩ環(huán)突變型ESBLs：Asp179→Ala 、Arg,,A類β-內(nèi)酰胺酶與B類、C類

16、和D類酶的同源性比較,B類β-內(nèi)酰胺酶 又稱金屬β-內(nèi)酰胺酶，Bush功能分類中屬于3組酶，能滅活青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗生素，但對(duì)安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制劑克拉維酸和氯唑西林對(duì)它無(wú)作用 。金屬酶的功能亞分類 ：3a、3b、3c金屬酶的分子生物學(xué)亞型分類 :B1、B2、B3,亞分類 物學(xué)亞類 酶的型別 宿主 發(fā)現(xiàn)國(guó)家 發(fā)現(xiàn)時(shí)間 分子量 等

17、電點(diǎn) 3a B1 CcrA3 脆弱擬桿菌 美國(guó) 1994 26 未測(cè)3a B1 CcrA4 脆弱擬桿菌 美國(guó) 1994 26 未測(cè)3a

18、 B1 CcrA 脆弱擬桿菌 美國(guó) 1986 26 5.23a B1 PCM-1 洋蔥假單胞菌 未知 1994 未測(cè) 8.53a B1 I

19、MP-1 銅綠假單胞菌 日本 1991 28 9.0 3a B1 IMP-2 不動(dòng)桿菌屬 意大利 2019 26 8.1 3a B1 IMP-3 銅綠假

20、單胞菌 日本 2000 3a B1 IMP-4 不動(dòng)桿菌屬 香港 2019 8.0 楊氏枸櫞酸桿菌

21、 中國(guó) 2019 未測(cè) 未測(cè) 3a B1 IMP-6 粘質(zhì)沙雷菌 日本 2019 未測(cè) 未測(cè) 3a B1 IMP-7 銅綠假單胞菌 加拿大 2019

22、 3a B1 IMP-8 肺炎克雷伯菌 中國(guó)臺(tái)灣 2019 未測(cè) 8.2 3a B1 VIM-1 銅綠假單胞菌 意大利 2019 5.3 3a

23、 B1 VIM-2 銅綠假單胞菌 法國(guó) 2000 未測(cè) 未測(cè) 3a B1 VIM-3 銅綠假單胞菌 臺(tái)灣 2000 未測(cè) 5.1 3b B2

24、 CphA 嗜水氣單胞菌 意大利 1993 28 8.03b B2 A2h 嗜水氣單胞菌 美國(guó) 1990 28 8.03b B2 ACP

25、 嗜水氣單胞菌 蘇格蘭 2019 31 8.23b B2 AsbM1 簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌 美國(guó) 1990 34 9.13b B2 AsA-1 殺蛙氣單胞菌 蘇格蘭

26、 1994 19 >7.93b B2 Imis 溫和氣單胞菌 英國(guó) 2019 未測(cè) 9.3c B2 戈氏軍團(tuán)菌

27、 1986 25 10.53a B3 L1 嗜麥芽窄食單胞菌 日本 1982 118 6.9,,,,,B類β-內(nèi)酰胺酶,,,,金屬酶的三維結(jié)構(gòu)圖 A：CcrA（脆弱擬桿菌） B：BcⅡ（蠟樣芽胞桿菌） C：L1（嗜麥芽窄食單胞菌）園柱代表α螺旋，板片代

28、表β片層 綠色數(shù)字為His殘基，蘭灰色數(shù)字為Asp殘基，橙色數(shù)字為Cys或Ser殘基。,A,B,C,獲得性金屬酶 （1）IMP型金屬酶 （2） VIM型金屬酶,,β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)1．酶蛋白性質(zhì)分析：包括表型分析和酶動(dòng)力學(xué)分析。2．基因分析：基因型別分類、測(cè)序、分析其結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控 基因。3．轉(zhuǎn)移性分析：分析酶編碼基因位于質(zhì)粒上還是染色體上；

29、 在不在整合子中。,收集菌株 耐藥表型分析（紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)分析） 提取酶粗制品進(jìn)行三相水解試驗(yàn)、等電聚焦電泳和酶動(dòng)力學(xué)分析

30、 根據(jù)結(jié)果判定酶的類群，選擇相應(yīng)PCR引物擴(kuò)增 陽(yáng)性 陰性

31、 整合子PCR初篩 陽(yáng)性 陰性

32、 鳥槍法克隆可表達(dá)

33、 β-內(nèi)酰胺酶基因 測(cè)定PCR產(chǎn)物序列 PCR擴(kuò)增全 測(cè)定全克隆片段

34、 可變區(qū)并測(cè)序 序列整合子檢查 提取質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn) 克隆并轉(zhuǎn)化到DH5α表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶

35、 陽(yáng)性 陰性 鈣轉(zhuǎn)或MgCl2或電轉(zhuǎn)化,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,（2）耐藥表型分析：紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)測(cè)定MICs（3）酶性質(zhì)分析：提取酶粗提物進(jìn)行a.三相水解試驗(yàn)。b.等電聚焦電泳。C.酶動(dòng)力學(xué)分析。（4）基因分析：a.PCR擴(kuò)增及PC

36、R產(chǎn)物測(cè)序。b.PCR擴(kuò)增整合子全可變區(qū)，分析其中結(jié)構(gòu)和可能的β-內(nèi)酰胺酶基因。C.鳥槍法克隆可表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶基因，分析基因結(jié)構(gòu)。（4）轉(zhuǎn)移性分析：A。質(zhì)粒：a.質(zhì)粒接合試驗(yàn)。b.轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：電轉(zhuǎn)化、鈣轉(zhuǎn)化或MgCl2轉(zhuǎn)化 B。整合子：a.PCR擴(kuò)增整合子全可變區(qū)及PCR產(chǎn)物序列測(cè)定。,ESBLs和AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè),,一、ESBLs的檢測(cè),1．紙片法： 表1 肺克、催娩克雷

37、伯、大腸埃希菌ESBLs產(chǎn)株紙片法初篩和確證實(shí)驗(yàn)2 ．MIC法： 表2 肺克、催娩克雷伯、大腸埃希菌ESBLs產(chǎn)株MIC法初篩和確證實(shí)驗(yàn),,驗(yàn)方法 初篩試驗(yàn) 表型確證試驗(yàn)培養(yǎng)基 MH

38、 MH 抗菌藥物濃度 頭孢泊肟 10μg 或 頭孢他啶 30μg 頭孢他啶 30μg 或 頭孢他啶/克拉維酸 30/10μg

39、 氨曲南 30μg 或 和 頭孢噻肟 30μg 或 頭孢噻肟 30μg 頭孢曲松 30μg

40、 頭孢噻肟/克拉維酸 30/10μg （同時(shí)用多于一種抗生素可提高試驗(yàn)靈敏度） （確證試驗(yàn)要求同時(shí)做上述四種紙片） 孵育條件 同標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法 同標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法結(jié)果 頭孢泊肟抑菌圈 ≤22mm

41、 有一種抗生素出現(xiàn)加有克拉維酸紙片抑菌圈≥ 頭孢他啶抑菌圈 ≤22mm 沒(méi)有加克拉維酸紙片抑菌圈5 mm=產(chǎn)ESBL氨曲南抑菌圈 ≤27mm頭孢噻肟抑菌圈 ≤27mm頭孢曲松抑菌圈 ≤25mm=可疑產(chǎn)ESBL質(zhì)量控制 陰性對(duì)照 ATCC25922   陰 性對(duì)照 ATC

42、C25922加有克拉維酸 （參考質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)） ≤沒(méi)有加克拉維酸抑菌圈 2mm 陽(yáng)性對(duì)照 ATCC700603頭孢泊肟抑菌圈 9-16mm 頭孢他啶/克拉維酸抑菌圈 頭孢他啶抑菌圈 10-18mm

43、 ≥頭孢他啶抑菌圈5 mm氨曲南抑菌圈 9-17mm頭孢噻肟抑菌圈 17-25mm 頭孢噻肟/克拉維酸抑菌圈頭孢曲松抑菌圈 16-24mm ≥頭孢噻肟抑菌圈3 mm,,,,,,,,,,,驗(yàn)方法 初篩試驗(yàn)

44、 表型確證試驗(yàn)培養(yǎng)基 CAMHB CAMHB 抗菌藥物濃度 頭孢泊肟 1μg /mL或 頭孢他啶 0.25-128 μg /mL 頭孢他啶

45、1μg /mL或 頭孢他啶/克拉維酸 0.25/4-128/4μg 氨曲南 1μg /mL或 和 頭孢噻肟 1μg /mL或 頭孢噻肟 0.25-64 μg /mL

46、 頭孢曲松 1μg /mL 頭孢噻肟/克拉維酸 0.25/4-64/4μg （同時(shí)用多于一種抗生素 （確證試驗(yàn)要求同時(shí)做上述 可提高試驗(yàn)靈敏度） 四種紙片

47、） 孵育條件 同標(biāo)準(zhǔn)MIC法 同標(biāo)準(zhǔn)MIC法結(jié)果 生長(zhǎng)=可疑產(chǎn)ESBL 有一種抗菌素生素出現(xiàn)加有克拉維酸 （例： MIC ≥ 2 μg /mL） 的MIC≥沒(méi)有加克拉維酸的MIC 3個(gè)對(duì)

48、 倍稀釋度 =產(chǎn)ESBL質(zhì)量控制 陰性對(duì)照 ATCC25922 =無(wú)生長(zhǎng) 陽(yáng)性對(duì)照 ATCC700603 陽(yáng)性對(duì)照 ATC

49、C700603頭孢泊肟抑菌圈 ≥ 2 μg /mL 有一種抗菌素生素出現(xiàn)加有克拉維頭孢他啶抑菌圈 ≥ 2 μg /mL 的MIC≥沒(méi)有加克拉維酸的MIC 3個(gè)對(duì) 氨曲南抑菌圈 ≥ 2 μg /mL 倍稀釋度頭孢噻肟抑菌圈 ≥ 2 μg /mL 頭孢曲松抑菌圈 ≥ 2 μg /mL,,,,,,,,,,二、AmpC β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè),1．初篩試驗(yàn)2 ．頭孢

50、西丁三相水解試驗(yàn)3 ．聯(lián)合用克拉維酸和氯唑西林兩種抑制 平行試驗(yàn),,AmpC酶的檢測(cè)1．  酶的提取 凍融法 超聲波破碎法 1個(gè)菌落

51、 1個(gè)菌落  種入12ml大豆湯。35度震搖4-6h 種入40ml大豆湯。35度震搖過(guò)夜 4度40000rpm，離心20min，去上清液 4度4000rpm，離心20分鐘，去上清 沉淀物-890度反復(fù)凍溶5次 重懸在5mlpH7.0 的.01MPBS中， 加入1.5mlpH7.0的0.01M

52、PBS， 超聲波破碎10秒，間隔15秒重復(fù) 旋轉(zhuǎn)混勻。 10次 4度12,000轉(zhuǎn)rpm離心20分鐘 4度12,000rpm離心20分 取上清，-20度保存?zhèn)溆?

53、 取上清液，-20度保存?zhèn)溆?,,,,,,,,,,,,,1．  測(cè)定方法 0. 5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊拇竽c桿菌ATCC25922 涂在MH平皿上，中心貼頭孢西丁紙片（30）  切出3-4個(gè)不同方向的狹縫，鉤出其中的瓊脂   每溝中加入待測(cè)菌的40 的粗提物 35度孵育過(guò)夜