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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分,
目的:了解ampD基因特異突變對(duì)陰溝腸桿菌AmpCβ-內(nèi)酰胺酶由非持續(xù)高產(chǎn)型轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)型的影響作用。
方法:通過(guò)細(xì)菌鑒定、藥敏試驗(yàn),改良頭孢西丁三維試驗(yàn)和質(zhì)粒ampC基因的擴(kuò)增,篩選染色質(zhì)介導(dǎo)的產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的陰溝腸桿菌,擴(kuò)增其染色質(zhì)ampD基因、測(cè)序并比對(duì),確定其有義突變位點(diǎn)。采用定點(diǎn)突變的方法對(duì)野生型陰溝腸桿菌ampD基因進(jìn)行上述特異位點(diǎn)的突變,形成相應(yīng)的定點(diǎn)突變菌株;然后再用野
2、生型ampD基因代替臨床原始菌株的ampD基因,形成回復(fù)突變菌株。最后用改良頭孢西丁三維試驗(yàn)和AmpCβ-內(nèi)酰胺酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)測(cè)定突變前后菌株和回復(fù)突變菌株產(chǎn)酶類型的改變。
結(jié)果:臨床收集的121株陰溝腸桿菌中,15株為染色質(zhì)介導(dǎo)的產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶的菌株,共篩選出ampD基因的8個(gè)有義突變位點(diǎn),形成7株定點(diǎn)突變菌株。其中EclMA(274位插入A)、EclMC(327位缺失C)和EclMF(27位插入G)由非持續(xù)高產(chǎn)型轉(zhuǎn)
3、變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)型,而EclMB(371位插入T)、EclMD(515位缺失C)、EclME(324位C變?yōu)锳)、EclMG(兩點(diǎn)同時(shí)的突變238C→A302T→A)的產(chǎn)酶類型未發(fā)生變化。從氨基酸水平分析,產(chǎn)酶類型發(fā)生改變的菌株的氨基酸改變分別為:93-169位全部改變(170/110位終止)、109-132位全部改變(133位終止)、10-25位全部改變(26位終止);而產(chǎn)酶類型未發(fā)生改變的菌株氨基酸的變化為:124-169位全部改變(1
4、70位終止)、172-187位全部改變(187位未終止)、108位變?yōu)榻K止密碼、80R→S101M→K。
結(jié)論:陰溝腸桿菌ampD基因中的3個(gè)特異基因突變導(dǎo)致的氨基酸移碼突變可使AmpC酶由非持續(xù)高產(chǎn)型轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)型。ampD基因編碼的AmpD酰胺酶可分解包括N-乙酰胞壁酰酐三肽在內(nèi)的粘肽成分,而這種分解作用很可能依賴AmpD酰胺酶的一個(gè)假設(shè)的活性區(qū)域。從我們的研究結(jié)果顯示,該活性區(qū)域很可能起源于ampD基因的25位或以后(
5、即AmpD蛋白的第9個(gè)氨基酸或之后),而終止于ampD基因的321位或以前(即AmpD蛋白的第107個(gè)氨基酸或之前)。而在上述活性區(qū)域內(nèi)的單個(gè)點(diǎn)突變?cè)斐傻膯蝹€(gè)氨基酸的突變有可能并不對(duì)整個(gè)AmpD酰胺酶活性區(qū)域產(chǎn)生影響。當(dāng)然我們也不排除ampD基因突變對(duì)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶存在其他的影響機(jī)制。上述假設(shè)有待進(jìn)一步研究。
第二部分,
目的:從體內(nèi)研究的水平揭示誘導(dǎo)型向持續(xù)高產(chǎn)型AmpCβ-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)變的耐藥菌的轉(zhuǎn)變率,并對(duì)
6、其間患者的基礎(chǔ)疾病情況和抗菌藥物應(yīng)用情況加以分析,對(duì)產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶菌株的臨床控制和治療起到初步提示的作用。
方法:篩選攜帶產(chǎn)誘導(dǎo)型AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性桿菌的患者作為研究對(duì)象,定期收集其感染標(biāo)本,至其攜帶菌株的AmpCβ-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)化為持續(xù)高產(chǎn)型,并對(duì)其菌種、基礎(chǔ)疾病和期間抗生素使用情況進(jìn)行數(shù)據(jù)收集,使用統(tǒng)計(jì)分析軟件stata8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果:兩家醫(yī)院共收集成為研究對(duì)象的感染患者559人,收
7、集到實(shí)驗(yàn)入主菌株714株,其中銅綠假單胞菌527株,摩根摩根菌26株,鮑曼不動(dòng)桿菌41株,粘質(zhì)沙雷氏菌25株,陰溝腸桿菌60株,產(chǎn)氣腸桿菌35株。這些菌株中有33株的AmpC酶由誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)型,轉(zhuǎn)變率為4.6%,各種細(xì)菌的轉(zhuǎn)變率分別為銅綠假單胞菌3.4%、摩根摩根菌7.7%、鮑曼不動(dòng)桿菌4.9%、粘質(zhì)沙雷氏菌0%、陰溝腸桿菌13.3%、產(chǎn)氣腸桿菌占8.6%。腦血管疾病患者的陽(yáng)性轉(zhuǎn)變率與非腦血管疾病患者相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,優(yōu)勢(shì)比
8、OR=4.9。在基礎(chǔ)疾病等其他條件相同的情況下,頭孢菌素類藥物應(yīng)用天數(shù)與轉(zhuǎn)變率呈負(fù)相關(guān),而碳青霉烯類藥物應(yīng)用天數(shù)與轉(zhuǎn)變率呈正相關(guān),其他抗菌藥物應(yīng)用天數(shù)與產(chǎn)酶類型陽(yáng)性轉(zhuǎn)變率未見(jiàn)明顯的相關(guān)性,而應(yīng)用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物還是非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物未對(duì)陽(yáng)性率結(jié)果產(chǎn)生明顯差異。
結(jié)論:銅綠假單胞菌(73.8%)是引起院內(nèi)感染的最常見(jiàn)的產(chǎn)誘導(dǎo)型AmpC酶的細(xì)菌;陰溝腸桿菌(13.3%)產(chǎn)酶類型的陽(yáng)性轉(zhuǎn)變率最高。參與診治腦梗塞或其后遺癥患者
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