pcr的生物安全

1、,臨床PCR實驗室生物安全,,克州人民醫(yī)院 高峰,outline,總論,凡是為預防、診斷、治療任何人類疾病或損傷、或者評價人類健康而對人體的物質(zhì)進行生物、微生物、血清化學、血液、生物物理、細胞或者其他類型檢驗的部門，統(tǒng)稱為臨床實驗室,實驗室每天要處理來自臨床的標本，如血液、穿刺液、分泌物等，對這些“未知疾病標本”無法得知其危險程度，因此，每個臨床實驗室每天都面臨生物安全隱患,,真菌,病毒,細菌,臨床實驗室危害源,,,,,,,寄生蟲,,

2、易燃性、腐蝕性、有毒性、強酸性化學品等,,電器設(shè)備、輻射、噪聲等,,,,生物源危害,來源： 臨床實驗室中處理的病人標本（細菌、病毒、真菌、寄生蟲）,細菌（bacteria）,結(jié)核桿菌 Mycobacterium tuberculosis. Rod-shaped Bacterium,白喉桿菌 Corynebacterium diphtheriae. Rod,clubed-shaped Bacterium (cau

3、ses diphtheria),病毒 （viruses）,狂犬病病毒 Rabies,,DNA腫瘤病毒 DNA tumor viruses,脊髓灰質(zhì)炎病毒 polio,Harrington和Shannon在1976年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌、乙型肝炎病毒與志賀菌已成為英國臨床實驗室工作人員最為常見的職業(yè)性感染原因,臨床實驗室生物污染的原因及種類,空氣污染水的污染人體污染物體表面的污染,空氣污染,內(nèi)： 平面布局、氣流方向

4、 —— 合理 死角區(qū)域 —— 縮小外： 直接外排或擴散 ———— 高效過濾 ———— 密閉或壓力差,水、人體、物體表面污染,實驗過程中產(chǎn)生的大量污水 —— 特殊處理后排放工作人員實驗室感染（接觸、吸入） —— 專門防護規(guī)程物體表面污染（濺出、溢出、穿用錯誤等）

5、 —— 正確操作,化學源危害,含義： 臨床實驗室內(nèi)的部分化學品具有易燃、可燃、刺激、腐蝕性或劇毒性等危害,物理源危害,來源： 噪音 輻射紫外線電磁場其他,實驗室工作人員在實驗過程中受到實驗室生物污染而發(fā)生的感染,實驗室感染,東北農(nóng)大師生因動物實驗感染嚴重傳染病,2019年12月，東北農(nóng)業(yè)大學30名學生在實驗室進行“羊活體解剖學實驗

6、”，因?qū)嶒瀯游镔徺I未按《黑龍江省實驗動物管理條例》，未要求養(yǎng)殖場出具有關(guān)檢疫合格證明， 使28人被感染布魯氏菌病 布病結(jié)核,2019年9月9日，新加坡一名患者被確診感染了非典病毒。 這名27歲的男子是新加坡國立大學專門研究西尼羅病毒的微生物實驗室的一名研究生。由11名專家組成的國際調(diào)查小組認為，不恰當?shù)膶嶒灣绦?、以及西尼羅病毒樣本與非典冠狀病毒在實驗室里的交叉感染，可能是這名患者感染非典病毒的原因,新加坡的實驗室SARS感染事件,實

7、驗室感染的途徑,空氣傳播：接種環(huán)、吸管、注射器使用時經(jīng)口傳播直接接種：針刺、劃傷等黏膜接觸：如HIV能通過眼結(jié)膜進入人體節(jié)肢動物媒介（叮咬等）,消化道攝入傳播,實驗室感染的發(fā)生率(Britain) 志賀菌臨床實驗室感染 0.322‰ 沙門菌臨床實驗室感染 0.137‰其他腸道致病菌如弧菌屬細菌、彎曲菌屬細菌及大腸埃希菌等的實驗室感染率極低,職業(yè)HIV感染,Occu

8、pationally acquired AIDS cases or HIV infections reported ti CDC through 1992 Occupation No. (%) of

9、 occupational transmissions Laboratory technician 25(24.8)

10、 Nurse 26(25.7) Physician

11、 13(12.8) Medical technician/paramedic 7(6.9) Dentist/dental technician

12、 6(5.9) Health aide/attendant 6(5.9) Housekee

13、per/maintenance worker 6(5.9) Morgue technician 3(3.0)

14、 Technician/therapist 3(3.0) Respiratory therapist

15、 2(2.0) Surgical technician 2(2.0) Other HCW

16、 2(2.0) Total 101 Adapte

17、d from D.L. Sewell, Clinical microbiology reviews,2019,389-405,,,,臨床實驗室安全管理,硬件管理,,實驗室設(shè)備,個人防護設(shè)備,生物安全防護（biosafety containment）指在實驗室環(huán)境下處理和保存感染性物質(zhì)的過程中采用的一系列的防護措施，包括一級防防和二級防護,一級防護與二級防護,一級防護： 包括規(guī)范操作技術(shù)與規(guī)程，配置適當?shù)陌踩O(shè)備，保護操作人

18、員和室內(nèi)直接環(huán)境免遭感染性物質(zhì)的污染二級防護： 包括合理的實驗室設(shè)施設(shè)計和嚴格規(guī)范的操作流程，用以保護實驗室外環(huán)境免受感染性物質(zhì)污染,個體防護裝備,個體防護裝備,裝備 避免的危害 安全性特征實驗服、隔離衣、連體衣 污染衣服 · 背面開口 · 罩在日常服裝外鞋襪

19、 碰撞和噴濺 · 不露腳趾護目鏡 碰撞和噴濺 · 防碰撞鏡片 · 側(cè)

20、面有護罩安全眼鏡 碰撞 · 防碰撞鏡片 · 側(cè)面有護罩面罩 碰撞和噴濺 · 罩住整個面部

21、 · 發(fā)生意外時易于取下,,,,個體防護裝備,裝備 避免的危害 安全性特征防毒面具 吸入氣溶膠 · 在設(shè)計上包括一次性使用的、整 個面部或一半面部空氣凈化 的、整個面部或加罩的動力空

22、 氣凈化的以及供氣的防毒面具 手套 直接接觸微生物 · 得到微生物學認可的一次性乳 劃破 膠、乙烯樹脂或聚腈類材料 · 保護手

23、 · 網(wǎng)孔結(jié)構(gòu),,,,生物安全柜,環(huán)境空氣→進入工作臺→過濾→樣本→高效過濾→排入室內(nèi)或室外采用負壓裝置，形成氣幕防護屏障，保護操作人員安全,實驗室分區(qū),清潔區(qū)：包括辦公室、休息室、培養(yǎng)基室等半污染區(qū)：包括緩沖間、更衣室和衛(wèi)生通道等污染區(qū)：包括樣本收集區(qū)、處理區(qū)、培養(yǎng)區(qū)和廢棄物處理區(qū)等,實驗室的出口和通道必須保持暢通無阻，不準堆放物品、垃圾、裝置或設(shè)備,出口通路,BSL-2級實驗室

24、生物安全,二級生物安全防護實驗室安全操作規(guī)程,1.禁止非工作人員進入實驗室。參觀實驗室等特殊情況須經(jīng)實驗室負責人批準后方可進入。2.接觸微生物或含有微生物的物品后，脫掉手套后和離開實驗室前要洗手。 3.禁止在工作區(qū)飲食、飲水、吸煙、處理隱形眼鏡、化妝及儲存食物。 4.以移液器吸取液體，禁止口吸。,,,,,,,,,二級生物安全防護實驗室安全操作規(guī)程,5.制定尖銳器具的安全操作規(guī)程。 6.按照實驗室安全規(guī)程操作，降低濺出和氣溶膠

25、的產(chǎn)生。 7.每天至少消毒一次工作臺面，活性物質(zhì)濺出后要隨時消毒。 8.所有培養(yǎng)物、廢棄物在運出實驗室之前必須進行滅活，如高壓滅活。需運出實驗室滅活的物品必須放在專用密閉容器內(nèi)。 9.制定有效的防鼠防蟲措施。,二級生物安全防護實驗室安全操作規(guī)程,10.實驗室入口處須貼上生物危險標志,內(nèi)部顯著位置須貼上有關(guān)的生物危險信息,包括使用傳染性材料的名稱,負責人姓名和電話號碼。11.進行感染性實驗時，禁止他人進入實驗室，或必須經(jīng)實驗室負

26、責人同意后方可進入。免疫耐受或正在使用免疫抑制劑的工作人員必須經(jīng)實驗室負責人同意方可在實驗室或動物房內(nèi)工作。,二級生物安全防護實驗室安全操作規(guī)程,12. 實驗室入口處須貼上生物危險標志，注明危險因子、生物安全級別、需要的免疫、負責人姓名和電話、進入實驗室的特殊要求及離開實驗室的程序。 13. 工作人員應(yīng)接受必要的免疫接種和檢測(如乙型肝炎疫苗、卡介苗等)。14.并根據(jù)需要定期收集血清樣本，應(yīng)有檢測報告，如有問題及時處理。,二級生物

27、安全防護實驗室安全操作規(guī)程,15.將生物安全程序納入標準操作規(guī)范或生物安全手冊，由實驗室負責人專門保管，工作人員在進入實驗室之前要閱讀規(guī)范并按照規(guī)范要求操作。 16.工作人員要接受有關(guān)的潛在危險知識的培訓，掌握預防暴露以及暴露后的處理程序。每年要接受一次最新的培訓。 17.嚴格遵守下列規(guī)定，防止利器損傷：,二級生物安全防護實驗室安全操作規(guī)程,17.1 除特殊情況(腸道外注射和靜脈切開等)外，禁止在實驗室使用針、注射器及其他利器。

28、盡可能使用塑料器材代替玻璃器材。 17.2 盡可能應(yīng)用一次性注射器，用過的針頭禁止折彎、剪斷、折斷、重新蓋帽、從注射器取下，禁止用手直接操作。用過的針頭必須直接放人防穿透的容器中。非一次性利器必須放入厚壁容器中并運送到特定區(qū)域消毒，最好進行高壓消毒。 17.3 盡可能使用無針注射器和其他安全裝置。 17.4 禁止用手處理破碎的玻璃器具。裝有污染針、利器及破碎玻璃的容器在丟棄之前必須消毒。,二級生物安全防護實驗室安全操作規(guī)程,18

29、.培養(yǎng)基、組織、體液及其他具有潛在危險性的廢棄物須放在防漏的容器中儲存、運輸及消毒滅菌。 19. 實驗設(shè)備在運出修理或維護前必須進行消毒。 20. 人員暴露于感染性物質(zhì)時，及時向?qū)嶒炇邑撠熑藚R報，并記錄事故經(jīng)過和處理方案21. 禁止將無關(guān)動物帶入實驗室。,PCR實驗室的生物安全,PCR技術(shù)的基本原理與PCR技術(shù)的特點,聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),又稱無細胞分子克隆系統(tǒng)或體外酶促基因

30、擴增法。PCR技術(shù)是由穆利斯 （Kary B Mullis）于1985年聯(lián)合創(chuàng)造的。該技術(shù)可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或?qū)γ?0萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品。,,PCR技術(shù)的基本原理,其原理類似于DNA的天然復制過程，PCR由變性－退火－延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一段時間后，模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的

31、雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準備；②模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；,PCR技術(shù)的基本原理,③引物的延伸DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性－退火－延伸三過程，就可獲得更多的“

32、半保留復制鏈”,這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板，每完成一個循環(huán)需2－4分鐘，2－3個小時就能將待擴目標基因擴增放大幾百萬倍。,PCR反應(yīng)特點,特異性強：PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②堿基配對原則；③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；④靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克

33、(pg=10- 12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。,PCR反應(yīng)特點,簡便、快速：PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴增反應(yīng)。一般采用實時熒光法進行分析，無放射性污染、易推廣。對標本的純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及總

34、RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。,PCR實驗室基本概況,臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個分隔開的工作區(qū)域：1.試劑貯存和準備區(qū)2.標本制備區(qū)3.擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當合并。,,,,,各個分區(qū)的生物安全規(guī)范,各工作區(qū)域有明確的標記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品禁止混用。進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方

35、向進行，即試劑貯存和準備區(qū)——標本制備區(qū)——擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)——擴增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。,各個分區(qū)的生物安全規(guī)范,具體包括以下物品各分區(qū)不可混用1.微量加樣器（覆蓋l－1000ul）2.移動紫外燈（近工作臺面）3.消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）4.專用工作服和工作鞋5.專用辦公用品等,（一）試劑貯存和

36、準備區(qū),貯存試劑和用于標本制備的材料應(yīng)直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。,在整個區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必

37、須經(jīng)高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。本工作區(qū)的實驗臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈（254nm波長），在工作完成后調(diào)至實驗臺上60－90cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。,（二）標本制備區(qū),

38、要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進人本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加人待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。用過的加樣器吸頭必須放人專門的消毒（例如含次氯酸鈉溶液）容器內(nèi)。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料（原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合

39、液等）如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。,對實驗臺適當?shù)淖贤庹丈洌?54nm波長，與工作臺面近距離）適合于滅活去污染。可移動紫外線管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。,（三）擴增區(qū),已制備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣本制備區(qū)）的加人和主反應(yīng)混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式PCR測

40、定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。不能從本區(qū)再進人任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。,為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。如有加樣則應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。打開預處理過的反應(yīng)混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大

41、多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理井作出記錄。,（四）擴增產(chǎn)物分析區(qū),本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用PCR－ELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時，必須使用洗板機洗板，廢液必

42、須收集至 lmol／L HCI中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠離 PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放工 lmol／L HCI中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。,由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如澳化乙錠、丙烯酸胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實驗人員的安全防護。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負壓條件或減壓情況下（如安裝排風扇）可減少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性,實驗室污染,這是

43、最常見的污染源，由于PCR技術(shù)可以在幾個小時內(nèi)將模板中某些特異性序列擴增到數(shù)百萬倍以上，擴增產(chǎn)物可能在電泳等過程中污染移液器、操作臺或隨著蒸發(fā)所形成氣溶膠而污染整個實驗室。擴增產(chǎn)物又是最有效的模板，一旦出現(xiàn)產(chǎn)物污染其污染程度都較嚴重。,實驗室污染,判斷方法：可以將實驗中最關(guān)鍵步驟如試劑分裝、樣品處理等轉(zhuǎn)移到一個新的環(huán)境中或轉(zhuǎn)移到超凈工作臺中完成。當然，所用移液器、吸咀管（離心管）都應(yīng)徹底更換。,,實驗室污染,解決方法：實驗室污染是PCR

44、擴增過程中最易出現(xiàn)的現(xiàn)象，而且一旦出現(xiàn)污染，消除污染源又極其困難，往往需對整個實驗室及實驗器材徹底清洗處理，所以應(yīng)該以預防為主，實驗過程中嚴格遵守實驗基本要求，樣品處理與擴增產(chǎn)物及電泳應(yīng)盡量分開，最好能在兩個房間進行。擴增前處理所用的移液器及擴增后點樣用的移液器應(yīng)嚴格地分開，不可互換。PCR室應(yīng)保持良好的通風、清潔、最好能專用。,在實驗室中引起火災的通常原因,1、超負荷用電2、電器保養(yǎng)不良，例如電纜的絕緣層破舊或損壞3、供氣管或電線

45、過長4、儀器設(shè)備在不使用時未關(guān)閉電源5、使用不是專為實驗室環(huán)境設(shè)計的儀器設(shè)備6、明火7、供氣管老化銹蝕8、易燃、易爆品處理、保存不當9、不相容化學品沒有正確隔離10、在易燃物品和蒸氣附近有能產(chǎn)生火花的設(shè)備11、通風系統(tǒng)不當或不充分,防火,隱患的估計和研究易燃易爆物火源隱患（電、火、氣、試劑）,現(xiàn)場配備： 滅火設(shè)備 報警裝置

46、 疏散路徑 通道標識,1. 加熱 ? 安全使用酒精燈2. 明火 ? 實驗室內(nèi)嚴禁吸煙 ? 在使用易燃氣體和易燃試劑的實驗室內(nèi)不得使用明火,滅火,學會使用滅火器（一拔、二握、三瞄、四掃）易燃固體、易燃氣體、易燃液體和帶電物體著火時，可用干粉滅火器滅火,滅火器基本知識,導線或電器

47、著火時，應(yīng)先斷電，再用干粉滅火器滅火衣服著火時，應(yīng)盡快地脫掉衣服，并用水滅火。或就地滾動，切忌外跑,,實驗室滅火推薦選用CO2滅火器,化學危險物品使用安全準則,所有化學危險品的容器都應(yīng)有清晰標記，實驗室管理人員有責任向工作人員介紹化學危險物品，應(yīng)有材料安全數(shù)據(jù)表顯示每一種化學危險物品的特性,2019年9月9日，香港科技大學一間實驗室9日發(fā)生有毒化學品泄漏事件，一名職員打開實驗室內(nèi)儲存柜時，發(fā)現(xiàn)柜內(nèi)一樽一公升已稀釋丙烯醛出現(xiàn)液體泄漏及冒