生物修復(fù)作用菌的競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用.pdf

1、傳統(tǒng)的依靠培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、分離、生化鑒定及計(jì)數(shù)的微生物研究方法，操作繁瑣、檢測(cè)周期長，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)微生物快速、特異、簡(jiǎn)便、敏感且低耗的快速檢測(cè)及研究的要求。近年來，微生物的快速檢測(cè)和自動(dòng)化研究進(jìn)展迅速。快速檢測(cè)及其自動(dòng)化已深入到分子水平，利用核酸雜交、抗原抗體反應(yīng)等對(duì)微生物進(jìn)行分離、檢測(cè)、鑒定和計(jì)數(shù)，使微生物的檢測(cè)更為靈敏、快速、準(zhǔn)確、方便。 競(jìng)爭(zhēng)PCR由Gilland等<'[1]>于1990年首先發(fā)明，其實(shí)質(zhì)是用合適的

2、內(nèi)對(duì)照模板(internal control template)與待測(cè)核酸(DNA或RNA)一起競(jìng)爭(zhēng)參與PCR反應(yīng)，并通過電泳使擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠上明顯分開，從而進(jìn)一步進(jìn)行定性或定量分析。競(jìng)爭(zhēng)PCR能消除管間及樣本間的變異，定量范圍較廣，能夠檢測(cè)2倍的差異。且此方法不需要昂貴的儀器設(shè)備，實(shí)驗(yàn)條件容易達(dá)到。因此本論文選用競(jìng)爭(zhēng)PCR建立了海水養(yǎng)殖環(huán)境生物修復(fù)作用細(xì)菌的快速定量檢測(cè)方法。 競(jìng)爭(zhēng)PCR定量方法的關(guān)鍵是內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)設(shè)計(jì)成功與否直

3、接影響競(jìng)爭(zhēng)PCR反應(yīng)。本文通過將細(xì)菌特定DNA片段經(jīng)雙酶切缺失中間一小片段，將余下的2個(gè)較大片段連接，并用相同的引物在相同條件下擴(kuò)增連接產(chǎn)物，從而獲得截短的同源性片段，作為內(nèi)標(biāo)。制備時(shí)，將其純化后克隆于pMD18-T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR鑒定，驗(yàn)證無誤后作為競(jìng)爭(zhēng)性模板內(nèi)對(duì)照。將內(nèi)標(biāo)模板按一定比例稀釋后分別與等體積細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR，結(jié)果表明目的DNA與競(jìng)爭(zhēng)性DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物之間具有明顯的線性競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，結(jié)合其他細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，建立了

4、內(nèi)標(biāo)模板量與原樣品中細(xì)菌數(shù)量的線性方程。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了與預(yù)期PCR產(chǎn)物大小相當(dāng)?shù)奶禺愋詶l帶且敏感性較好。本競(jìng)爭(zhēng)PCR方法的靈敏度可達(dá)到10<'0.5>ng/μL，檢測(cè)時(shí)間從平板計(jì)數(shù)需花3-5天到只需2天即能完成，大大提高了檢測(cè)速度，節(jié)省了大量的時(shí)間和試劑，并且可以定量檢測(cè)特定的細(xì)菌。 在建立了競(jìng)爭(zhēng)PCR定量檢測(cè)方法后，我們應(yīng)用此方法檢測(cè)了2006年冬季和2007年春季浙江象山港海灣網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)沉積環(huán)境中這

5、兩類菌的分布情況，五個(gè)區(qū)域分別為網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)、貝類養(yǎng)殖區(qū)、海帶養(yǎng)殖區(qū)、離網(wǎng)箱較近的對(duì)照區(qū)、離網(wǎng)箱較遠(yuǎn)的對(duì)照區(qū)。檢測(cè)結(jié)果表明，無論在春季樣品中還是冬季樣品中菌株Y都比菌株J<,3>多一個(gè)或兩個(gè)數(shù)量級(jí)；在五個(gè)區(qū)域中網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)菌量最大，春季樣品中J<,3>菌量為1.47×10<'4>個(gè)/g，Y菌量為4.59×10<'4>個(gè)/g；但同一區(qū)域春季與冬季相比，除離網(wǎng)箱較遠(yuǎn)的對(duì)照區(qū)外，同一區(qū)域J3菌春季比冬季要多出一個(gè)數(shù)量級(jí)。Y菌除了海帶養(yǎng)殖區(qū)可看出增