植物組織培養(yǎng)的污染問(wèn)題

1、1、真菌的污染真菌(fungi)一類沒有葉綠素，異養(yǎng)的真核微生物。除極少數(shù)種類是單細(xì)胞外，絕大多數(shù)是由多細(xì)胞組成的菌絲，結(jié)成一團(tuán)的菌絲稱菌絲體，菌絲分有隔菌絲和無(wú)隔菌絲兩種。有隔菌絲是由多個(gè)細(xì)胞組成，相鄰的細(xì)胞之間由隔絲隔開。在地球上廣泛存在于空氣、水、土壤以及各類生物的體表或體內(nèi)。皆可有真菌生長(zhǎng)。大氣中已知的真菌有11255屬10萬(wàn)種，在室內(nèi)常附著在物體表面，能自動(dòng)或隨人的活動(dòng)而擴(kuò)散。種類豐富，分布廣泛，繁殖快速，無(wú)處沒有，無(wú)處不在。

2、一個(gè)季節(jié)繁殖45代，孢子可達(dá)1萬(wàn)億個(gè)室內(nèi)真菌種類：主要有芽枝孢霉屬、曲霉屬、鉸鏈孢霉屬、鐮刀霉屬、青霉屬等，真菌數(shù)量的多少，與溫度、濕度有很大關(guān)系。真菌以腐生、寄生或共生的型式進(jìn)行異營(yíng)性生活。釋放消化酵素於鄰近的環(huán)境，以分解食物成較小的水溶性分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)消化。並可於菌絲產(chǎn)生孢子以完成有性或無(wú)性繁殖。真菌季節(jié)變化：春、夏季尤其是南方的梅雨時(shí)節(jié)溫暖潮濕，非常適合真菌生長(zhǎng)。冬季室內(nèi)真菌濃度較高?？照{(diào)加重污染：如果長(zhǎng)期使用空調(diào)而不注意通風(fēng)，可

3、引起室內(nèi)真菌污染。室內(nèi)有空調(diào)比沒有空調(diào)情況下曲霧菌落數(shù)多4倍。2、細(xì)菌（bacteria）的污染細(xì)菌是一類微小的單細(xì)胞生物，約有２０００多種。從形態(tài)上看，細(xì)菌可以分成球菌、桿菌和螺旋菌３類。細(xì)菌是無(wú)孔不入的微生物，兒童玩具、手機(jī)、計(jì)算機(jī)鍵盤和衣服上，甚至植入人體的醫(yī)用植入物等（如心臟起搏器），都隨時(shí)有可能沾染細(xì)菌，對(duì)人體造成危害。為避免細(xì)菌的侵襲，科學(xué)家曾嘗試用抗微生物材料生產(chǎn)各種用品，但效果不十分理想，因?yàn)檫@些材料雖然能殺死細(xì)菌，卻充

4、滿化學(xué)物質(zhì)。細(xì)菌是處于生物和無(wú)生物之間的東西。泥土里、水里、都市的空氣里都有細(xì)菌散布著，多到50種以上。三類細(xì)菌的形狀：就是球形的，桿形的，及螺旋的。球形的有的正圓，有的卵圓；桿形的有長(zhǎng)有短，有的微彎螺旋形的也有長(zhǎng)短和彎曲的轉(zhuǎn)數(shù)多少的不同，有的生著細(xì)毛，毛長(zhǎng)與短多少不定。雖然概括地說(shuō)，形狀只有球形、桿形、螺旋形這幾種，但細(xì)分起來(lái)，形狀還是很不少。論大小，它長(zhǎng)約1～2微米，闊0.5微米余。病菌，能分泌出毒質(zhì)，如果寄生在體里，因病菌種類的不

5、同，人就會(huì)發(fā)生不同的疾病。3、組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染源[1]。戶外風(fēng)大菌類進(jìn)屋機(jī)會(huì)多[2]。屋內(nèi)太潮菌類繁衍多[3]。物品帶菌多[4]。屋內(nèi)不干凈[5]。屋內(nèi)清理帶菌組培苗[6]。接種不正確4、菌類傳播途徑[1]戶外風(fēng)傳播細(xì)小如塵隨風(fēng)飄散由上下落見濕就長(zhǎng)有風(fēng)就有沙有沙就有塵有塵就有菌菌塵混共存[2]渦流傳播我們?cè)诖蠼稚铣３？吹揭恍┐筘涇囻傔^(guò)后，馬路上的塵土、紙屑打著轉(zhuǎn)滿天飛，這就是汽車行駛攪動(dòng)空氣形成的渦流。汽車的前擋風(fēng)玻璃、車頂、車側(cè)、

6、車后都可以產(chǎn)生渦流。渦流在自然界可說(shuō)是無(wú)所不在，在這些渦流中人們?nèi)羰窍胍^察渦流旋轉(zhuǎn)方向改變的話就必須將整個(gè)渦流給破壞掉。超凈工作臺(tái)上，擺放物品太多，當(dāng)無(wú)菌風(fēng)吹過(guò)時(shí)，就會(huì)在物品周圍形成渦流群，菌類就會(huì)在渦流群中停留，從而降低凈化效果，增加污染機(jī)會(huì)。[3]接種傳播臟手每只帶有細(xì)菌4萬(wàn)~40萬(wàn)，干凈的手，指甲蓋大小也有3200多個(gè)細(xì)菌。指甲縫可以窩藏30多種細(xì)菌。1克重的指甲垢里竟藏有38億個(gè)細(xì)菌。洗的手3小時(shí)后，在大拇指的細(xì)菌由原來(lái)的30

7、0個(gè)變成30萬(wàn)個(gè)。如果手上帶菌較多，在操作過(guò)程中，就難免有菌落入培養(yǎng)基或植物材料上，而導(dǎo)致污染。用肥皂洗手比不用肥皂洗手的殺菌功效要大8~10倍。流動(dòng)的溫水可去掉95%以上。因此，在注意個(gè)人衛(wèi)生的同時(shí)，操作前一定要對(duì)手進(jìn)行徹底消毒。另外，不正確操作也會(huì)增加污染機(jī)率掀蓋生硬，滅菌不夠，操作過(guò)慢等。接種過(guò)程應(yīng)該輕開蓋，火滅慢，操作快。5、相應(yīng)的措施通風(fēng)：經(jīng)常開窗，保持室內(nèi)空氣流通可以使室內(nèi)真菌數(shù)量減少。通風(fēng)方法簡(jiǎn)便易行應(yīng)多使用。去濕：保持室

8、內(nèi)空氣干燥，如使用空調(diào)“除濕”功能，也可減少真菌生長(zhǎng)繁殖。光照：紫外線能殺滅或抑制真菌生長(zhǎng)，有調(diào)查發(fā)現(xiàn)下午一時(shí)是大氣細(xì)菌粒子沉降的一個(gè)低谷，說(shuō)明太陽(yáng)輻射對(duì)空氣微生物有明顯的殺滅作用。因此，保持室內(nèi)較好采光，在梅雨季節(jié)后將衣物等晾曬，對(duì)減少室內(nèi)真菌污染大有好處。防霉：污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷。2影響污染的因素21外植體本身植物組織培養(yǎng)的成敗除與培養(yǎng)基的組分有關(guān)外，另一個(gè)重要因素就是外植體本身，即由活體植物上切取下來(lái)，

9、用以進(jìn)行離體培養(yǎng)的那部分組織或器官。為了使外植體適于在離體條件下生長(zhǎng)，使組織培養(yǎng)工作順利進(jìn)行，有必要對(duì)外植體進(jìn)行選擇與處理。首先，應(yīng)該從田間或溫室中生長(zhǎng)健壯的無(wú)病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官或組織作為外植體，離體培養(yǎng)易于成功。對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，莖尖是較好的外植體，由于莖形態(tài)已基本建成，生長(zhǎng)速度快，遺傳性穩(wěn)定，病毒含量低或無(wú)病毒，所以是獲取無(wú)病毒苗的良好途徑。但是，不同植物的不同部位，由于其本身的生長(zhǎng)特點(diǎn)，在外植體培養(yǎng)中也存在著各種差

10、異性。比如，各部位的分化再生能力不同，各部位接種后的污染率也不同，各部位培養(yǎng)形成的再生植株的脫毒率也不同。所以選取外植體時(shí)應(yīng)選擇適當(dāng)大小的、病毒含量低的、易于消毒和滅菌的外植體，這樣才能保證在組織培養(yǎng)中污染率低、脫毒率高、成活率高。如在芳香植物唇萼薄荷的組織培養(yǎng)中，由于其組織非常柔嫩且表面密生絨毛，在自然條件下，表面常被霉菌和細(xì)菌污染。所以在培養(yǎng)時(shí)，選取去掉葉片的帶腋芽的幼嫩莖段進(jìn)行繁殖，這樣既能降低污染率(因?yàn)槿コ宋廴韭瘦^高的葉片)

11、，又能提高成活率。還如在廣佛手的組織培養(yǎng)中，不同外植體的頂芽的污染率最低，成活率最高，葉片次之，帶節(jié)莖的污染率最高。另外，不同季節(jié)取材的外植體，污染率也不同。如在廣佛手的培養(yǎng)中，春季取材與秋季取材差別不大，夏季污染率就高，明顯高于冬季。因此，適當(dāng)?shù)臅r(shí)候取材會(huì)降低污染率。所以，為了降低污染率、提高成活率選取外植體應(yīng)該從多方面考慮。2.2培養(yǎng)條件在培養(yǎng)室內(nèi)的培養(yǎng)條件中，溫度和濕度與污染率密切相關(guān)。外植體在夏季培養(yǎng)時(shí)，由于夏天高溫高濕有利于雜

12、菌滋長(zhǎng)，所以污染率就高；冬季培養(yǎng)時(shí)，污染率就相對(duì)低一些。如在廣佛手、矮牽牛、菊花、樹莓的組織培養(yǎng)中，外植體在夏季污染率和死亡率就高；在冬季就相對(duì)低一些。此外，一些用于組織培養(yǎng)的植物，在自然條件下的生長(zhǎng)環(huán)境也會(huì)影響污染率。有報(bào)道指出，生長(zhǎng)在高溫多雨的熱帶、亞熱帶植物和多年生木本植物容易出現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌的污染。內(nèi)生細(xì)菌存在于植物材料內(nèi)部，不能被一般的表面消毒方法所清除，隨著材料帶人培養(yǎng)過(guò)程引起污染。3防止措施組織培養(yǎng)中降低污染率是不可忽視的技術(shù)

13、環(huán)節(jié)。以下是在矮牽牛、菊花、樹莓等的組織培養(yǎng)中總結(jié)出來(lái)的幾點(diǎn)污染防止措施。31外植體的采集為了防止材料帶菌，我們?cè)诓杉庵搀w時(shí)，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：在生長(zhǎng)健壯的無(wú)病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的組織或器官；或?qū)⒛凵也杉貋?lái)，放在潔凈的空氣中水培抽芽，然后用這種新生組織培養(yǎng)，也可以避免污染。在晴天中午采集外植體。采集易于消毒和滅菌的組織部位進(jìn)行培養(yǎng)，也可以降低污染率。32材料的表面消毒外植體在接種之前，須經(jīng)嚴(yán)格的滅菌。由于滅菌劑的種類不同，殺菌力

14、不同，因此選擇消毒劑，既要考慮具有良好的消毒、殺菌作用，同時(shí)又易被蒸餾水沖洗掉或能自行分解的物質(zhì)，而且不會(huì)損傷或輕微損傷組織材料，而不影響生長(zhǎng)。植物種類不同，外植體不同，處理也不同。為了獲取無(wú)菌材料，對(duì)室外采集來(lái)的外植體，先用自來(lái)水沖洗干凈，然后根據(jù)材料的不同，選用不同種類的滅菌劑，進(jìn)行不同時(shí)間的表面滅菌。選擇適宜的消毒劑處理時(shí)，為了使其消毒效果更為徹底，有時(shí)還需與黏著劑或潤(rùn)濕劑如吐溫及抽氣減壓方法、磁力攪拌、超生振動(dòng)等方法配合使用，使