CP-25的合成及其抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性研究.pdf

1、白芍總苷(total glucosides of paeony,TGP)是從毛茛科植物白芍根部提取的有效成分,其藥效成分主要含有芍藥苷(paeoniflorin,Pae)、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷。Pae是TGP含量最多的活性成分,Pae和TGP均有一定的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。TGP是第一個(gè)來(lái)源于植物并作為抗炎免疫調(diào)節(jié)藥上市的抗類風(fēng)濕藥物,臨床長(zhǎng)期用藥實(shí)踐證明TGP不僅能改善關(guān)節(jié)炎病人的癥狀,同時(shí)在長(zhǎng)期用藥的過程中不

2、良反應(yīng)極少,無(wú)明顯毒副作用。然而TGP在臨床的起效較慢,TGP和Pae的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用也較弱。文獻(xiàn)報(bào)道單次給大鼠灌胃(intragastric administration,ig)Pae,其絕對(duì)生物利用度僅僅為3-4％,因此作為TGP主要藥效成分之一的Pae的吸收較差可能是其起效慢以及藥理活性較弱的原因之一。Pae口服吸收較差原因之一是其脂溶性較差,而Pae脂溶性較差主要是由于其分子結(jié)構(gòu)上的親水性羥基數(shù)目較多。因?yàn)镻ae的天然來(lái)源廣

3、泛,以Pae為原料藥進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾適于工業(yè)化生產(chǎn),故本課題通過酯化修飾對(duì)Pae進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,以期得到一個(gè)吸收較高,抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性更強(qiáng)的化合物。
　　二甲苯和大鼠角叉菜膠誘導(dǎo)的是急性炎癥反應(yīng),而小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(Delayed type hypersensitivity,DTH)是經(jīng)典的慢性免疫性炎癥和細(xì)胞免疫失衡,因此被用來(lái)考察CP-25的抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性。本文通過核磁共振技術(shù)(Nuclear Magnetic Resona

4、nce,NMR)和質(zhì)譜(Mass Spectrometry,MS)對(duì)Pae酯化修飾產(chǎn)物CP-25進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,并考察其最佳的合成工藝;考察CP-25的理化性質(zhì);研究CP-25在肝勻漿液和腸勻漿液的體外降解情況,為CP-25藥物劑型設(shè)計(jì)提供一定的依據(jù);考察靜脈注射(intravenous,iv)和ig后,CP-25在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程,并與相同給藥途徑的Pae比較藥動(dòng)學(xué)差異;通過二甲苯模型和角叉菜膠模型考察CP-25是否具有抗急性炎

5、癥的作用,通過DTH模型考察CP-25對(duì)慢性炎癥抑制作用和對(duì)細(xì)胞免疫失衡的調(diào)節(jié)作用,同時(shí)將CP-25的抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性分別與Pae和TGP相比較。為開發(fā)新藥CP-25提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:1.合成CP-25并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和工藝優(yōu)化;2.考察CP-25的理化性質(zhì);3.考察CP-25在腸勻漿液和肝勻漿液的降解情況;4.考察大鼠ig和iv CP-25的藥動(dòng)學(xué)特征,并與Pae比較;5.考察CP-25是否具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)活

6、性,并與Pae和TGP進(jìn)行比較。
　　方法:1.采用常規(guī)酰化反應(yīng)對(duì)CP-25進(jìn)行合成,利用MS和NMR對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,以CP-25的產(chǎn)率和Pae的回收率為指標(biāo),考察最佳的物料配比、催化劑、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溶劑;2.建立CP-25和Pae的高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)定量分析方法,考察其溶解度、穩(wěn)定性和油水分配系數(shù);3.建立大鼠肝勻漿液和腸勻漿液中C

7、P-25的HPLC定量分析方法,考察CP-25在肝勻漿液和腸勻漿液的降解情況;4.建立大鼠血漿中CP-25和Pae的HPLC定量分析方法,考察iv以及ig CP-25在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征,并與Pae進(jìn)行比較;5.分別建立小鼠二甲苯和大鼠角叉菜膠模型,以耳片和關(guān)節(jié)腫脹度為指標(biāo),考察CP-25對(duì)急性炎癥的抑制作用,并與TGP和Pae進(jìn)行比較;建立小鼠DTH模型,以耳片腫脹度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、組織病理學(xué)、T細(xì)胞增殖能力、白細(xì)胞介素(In

8、terleukin-2,IL-2)、IL-4、IL-10和IL-17的含量水平等方面考察CP-25對(duì)DTH小鼠慢性炎癥的抑制作用以及免疫調(diào)節(jié)作用,同時(shí)與TGP和Pae進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:
　　1.CP-25是Pae-6′-O單取代苯磺酸酯;其分子量為620,分子式為C29H32O13S,化學(xué)名為[(1aR,2S,3aR,5R,5aR,5bS)-5b-[(苯酰氧基)甲基]-3a,5,5a,5b-四氫-5-羥基-2甲基-2,5

9、亞甲基-3,4二氧雜-1H-環(huán)丁并環(huán)戊二烯-1a(2H)]6氧-苯磺?；?β-D-吡喃糖;CP-25產(chǎn)率為20%左右,其最佳合成工藝為1g Pae、20ml吡啶、20ml三氯甲烷和25mg的4-二甲氨基吡啶相互混合,在室溫下4小時(shí)內(nèi),將苯磺酰氯溶液(0.4ml苯磺酰氯溶解在150ml的丙酮中)緩慢滴加到三口瓶中,滴加完畢后,繼續(xù)攪拌8小時(shí),直至中止反應(yīng);采用最佳合成工藝連續(xù)四批CP-25,其純度依次為99.0%,98.80%,98.0%

10、,98.30%。
　　2.CP-25是白色結(jié)晶狀粉末有輕微的引濕性;微溶于水和石油醚,易溶于氯仿、甲醇和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑;CP-25穩(wěn)定性主要影響因素為濕度,CP-25的油水分配系數(shù)明顯大于Pae;CP-25紫外最大吸收波長(zhǎng)在230nm。
　　3.CP-25在肝臟和腸勻漿液能明顯降解,在肝勻漿液(5%,10%,25%)和腸勻漿液(2.5%,5%,12.5%),CP-25的半衰期依次為:4.60±0.47h,4.07±1.3

11、8h,3.45±0.89h,9.05±1.12,8.46±3.12,4.12±0.31;在腸道各區(qū)段中,以空腸和回腸對(duì)CP-25的降解作用較強(qiáng),在十二直腸,空腸,回腸和結(jié)腸,CP-25的半衰期依次為:17.50±3.00h,6.64±3.25h,6.14±3.12h,19.69±6.23h。
　　4.CP-25在大鼠血漿可以代謝分解出Pae;與iv Pae的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相比較,CP-25在大鼠體內(nèi)消除半衰期(t1/2β)較長(zhǎng),平均滯

12、留時(shí)間(MRT)明顯延長(zhǎng),清除率和體內(nèi)表觀分布容積均明顯增加;正常大鼠iv CP-25(6,12,24mg.kg-1)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)依次為:
　　分布相半衰期(T1/2α)為4.28±0.81、5.67±2.00、6.60±1.71min;消除相半衰期(T1/2β)為161.99±57.54、152.81±61.16、153.76±35.33min;藥時(shí)曲線下面積(AUC(0-tn))為65.13±14.16、154.20±28.

13、91、335.16±86.32mg/L*min;藥時(shí)曲線下面積(AUC(0-∞))為82.66±16.16、222.51±48.55、514.51±135.49mg/L*min;平均滯留時(shí)間(MRT(0-tn))為59.69±2.36、57.76±12.04、64.75±6.24min;平均滯留時(shí)間(MRT(0-∞))為115.22±23.49、135.76±33.05、170.95±34.97min;表觀分布容積(V)為2.38±0.

14、18、2.67±1.00、3.01±0.67 L/kg;清除率(CL/F)為0.06±0.01、0.05±0.01、0.05±0.01L/min/kg;CP-25口服吸收過程屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué),口服CP-25的吸收明顯多于Pae,兩者的絕對(duì)生物利用度依次為11.0%,3.6%;與口服Pae藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相比較,CP-25吸收半衰期(t1/2α)、消除半衰期(t1/2β)和平均滯留時(shí)間(MRT)明顯較長(zhǎng),藥時(shí)曲線下面積(AUC)以及表觀分布容積(

15、Vd)均高于Pae;正常大鼠ig CP-25(32,64,128mg.kg-1),藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)依次為:吸收相半衰期(T1/2α)為1.35±0.30、1.49±0.60、2.04±0.43h;消除相半衰期(T1/2β)為1.44±0.25、2.12±0.42、2.11±0.48h;表觀分布容積(V)為92.40±36.34、147.52±51.19、146.67±31.04L/kg;清除率(CL/F)為49.79±8.75、66.67

16、±3.94、58.17±6.91L/h/kg;藥時(shí)曲線下面積(AUC(0-tn))為0.40±0.04、0.71±0.05、1.78±0.14mg/L*h;藥時(shí)曲線下面積(AUC(0-∞))為0.66±0.12、0.96±0.06、2.23±0.26mg/L*h;平均滯留時(shí)間(MRT(0-tn))為2.71±0.06、3.40±0.05、4.30±0.25 h;平均滯留時(shí)間(MRT(0-∞))為5.17±1.26、5.43±1.05、5

17、.61±0.69h;達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為2.50±0.35、2.60±0.22、3.2±0.45h;峰濃度(Cmax)為0.12±0.01、0.19±0.03、0.44±0.09μg·ml-1;
　　5.CP-25能明顯抑制二甲苯和角叉菜膠誘導(dǎo)的急性炎癥,CP-25對(duì)急性炎癥的抑制作用要強(qiáng)于TGP和Pae給藥組;CP-25能明顯抑制DTH小鼠耳片的慢性炎癥,改善其耳片和脾臟組織病理學(xué);抑制胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和T細(xì)胞增殖;提高淋巴

18、細(xì)胞和血清中IL-4,IL-10的含量,同時(shí)降低IL-2和IL-17的分泌;CP-25對(duì)小鼠DTH慢性炎癥的抑制作用以及免疫調(diào)節(jié)作用要明顯強(qiáng)于TGP和Pae給藥組。
　　結(jié)論：
　　1.CP-25是Pae-6′-O單取代苯磺酸酯,經(jīng)中國(guó)專利數(shù)據(jù)庫(kù)、美國(guó)化學(xué)文摘、美國(guó)專利數(shù)據(jù)庫(kù)、歐洲專利數(shù)據(jù)庫(kù)和日本專利局等檢索系統(tǒng)檢索,未見與CP-25相關(guān)的報(bào)道,CP-25的合成工藝簡(jiǎn)便、快速,產(chǎn)量較大,基本可適用中試。
　　2.CP-