基于診斷治療學(xué)多功能納米系統(tǒng)用于肝細(xì)胞癌的分子診斷與治療.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，化學(xué)治療是臨床上主要的治療手段之一。目前，化療常常遇到以下兩個難題:
　?、僦委煼绞椒莻€體化，所有病人基于群體通用劑量給藥，會因病人個體差異等因素產(chǎn)生超敏或無效現(xiàn)象，導(dǎo)致用藥失敗;
　?、诏熜гu估往往在一個治療周期之后，具有時間滯后性，從而錯過了使治療最佳時機(jī)。
　　診斷治療學(xué)（Theranostics）是一種將分子診

2、斷與分子治療相結(jié)合的治療策略，近年來作為一種新型疾病治療策略，特別是在腫瘤治療方面受到了人們廣泛的關(guān)注?；谠\斷治療學(xué)的治療模式能夠?qū)崿F(xiàn)：
　?、倏梢暬幬矬w內(nèi)遞送過程;
　　②可視化藥物在給藥靶部位的分布和釋放過程;
　?、墼谥委煹耐瑫r進(jìn)行診斷，實現(xiàn)腫瘤治療的實時監(jiān)控和個體化給藥等。
　　因此，診斷治療學(xué)對HCC治療過程中治療效果的實時監(jiān)控、及時調(diào)整給藥劑量或治療方案、實現(xiàn)病人個體化給藥并提高腫瘤治療效果具有重

3、要意義。
　　本課題基于Theranostics理論，設(shè)計和制備一種多功能納米載體用于HCC的個體化給藥，以提高治療效果，降低毒副作用。首先，選擇聚合物納米粒作為Theranostics載體，設(shè)計合成具有載藥、長循環(huán)和方便后期修飾的多功能材料聚乳酸-聚乙二醇-聚賴氨酸(poly(lactic acid)-Poly(ethylene glycol)-Polylysine，PLA-PEG-PLL)，具有pH敏感性和長循環(huán)性的多功能材料

4、聚組氨酸-聚乙二醇-生物素(Polyhistidine-Poly(ethylene glycol)-Biotin，PLH-PEG-Biotin）;然后，選取紫杉醇(Paclitaxel，PTX)和索拉菲尼為治療HCC的模型藥物，基于釓(Gd)的磁共振顯影（Magnetic Resonance Imaging，MRI）模式為診斷手段，分別以腫瘤微環(huán)境高表達(dá)的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth fact

5、or,VEGF）、甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)和血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)為靶點，自組裝手段制備了三種多功能聚合物納米載體，分別為:
　?、侔邢蛑委煂W(xué)多功能納米粒（靶向VEGF載PTX聚合物納米粒，Target PTX-loaded nanoparticles，TPN）；
　?、谠\斷治療學(xué)多功能納米粒(靶

6、向AFP載Gd/PTX聚合物納米粒，Target Gd/PTX-loaded nanoparticles，TGPN)；
　?、踦H敏感診斷治療學(xué)多功能納米粒(pH敏感靶向VEGFR載Gd/PTX聚合物納米粒，Target pH-sensitive theranostic nanoparticles，TPTN);
　　最后，分別對三種多功能納米載體的理化性質(zhì)、體外釋放行為、細(xì)胞毒性、細(xì)胞攝取、體外MRI性質(zhì)、體內(nèi)MRI性質(zhì)、體

7、內(nèi)抑瘤性質(zhì)和組織安全性等進(jìn)行評價，以期提高HCC的分子靶向治療和治療監(jiān)控效果，實現(xiàn)HCC病人個體化治療。
　　課題主要研究方法與結(jié)果如下:
　　1.多功能材料的合成與表征
　　為構(gòu)建多功能診斷治療學(xué)聚合物納米載體，課題首創(chuàng)聚合物綴合技術(shù)，合成兩種新型多功能高分子材料PLA-PEG-PLL和PLH-PEG-Biotin。聚合物綴合技術(shù)是指利用化學(xué)反應(yīng)，將具不同功能的單嵌段材料化學(xué)連接得到多嵌段多功能聚合物的技術(shù)。與傳統(tǒng)聚

8、合反應(yīng)方法比較，該方法合成過程簡單，無需嚴(yán)苛的反應(yīng)條件，產(chǎn)物純化簡單，并能夠相對準(zhǔn)確地控制每一嵌段的分子量。此外，利用聚合物綴合技術(shù)可以將任意具有活性基團(tuán)的嵌段相連接，具有多嵌段材料制備的可創(chuàng)造性。
　　1.1、PLA-PEG-PLL的合成與表征
　　利用酰胺反應(yīng)，將PLA-COOH分別連接NH2-PEG-NH2得到PLA-PEG-NH2，然后連接PLL(Cbz)-COOH得到PLA-PEG-PLL(Cbz)，最后氨基脫保護(hù)

9、得到結(jié)合載藥、長循環(huán)和易于修飾多功能于一體的多功能材料PLA-PEG-PLL。通過核磁驗證了每一步合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。通過凝膠色譜得到PLA，PLA-PEG和PLA-PEG-PLL的數(shù)均分子量和多分散系數(shù)分別為13691(1.427)、16013(1.277)和20441(1.358)。利用芘熒光探針法測得PLA-PEG-PLL的臨界膠束濃度值為7.70×10-3mg/mL(3.76×10-7Mol/L)?；赑LA-PEG-PLL，利用酰

10、胺反應(yīng)，合成了PLA-PEG-PLL-DTPA和PLA-PEG-PLL-Biotin，分別用于Gd裝載和靶向抗體修飾。
　　1.2、PLH-PEG-Biotin
　　利用酰胺反應(yīng)，將Biotin-PEG-NH2與PLH-COOH反應(yīng)得到PLH-PEG-Biotin，通過核磁驗證了合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。通過酸堿滴定實驗證明PLH-PEG-Biotin pKb值在pH5～7之間，處于血液pH與腫瘤微環(huán)境pH之間，具有在腫瘤組織實現(xiàn)納米

11、粒pH敏感性釋藥的能力。
　　2.靶向治療學(xué)多功能納米粒的制備與表征
　　靶向治療能夠提高HCC的治療效果，降低化療藥物對正常組織的毒性，是目前研究的熱點之一。因此，本文首先制備TPN用于HCC的靶向治療。首先建立PTX高效液相色譜檢測方法，PTX在選定液相條件下峰型良好，符合方法學(xué)考察要求。利用自組裝方法制得TPN外觀圓整，呈球形或類球形，粒徑為203.6±4.10nm，Zeta電位為20.76±0.34mv，包封率和載藥

12、量分別為86.23±1.79％和1.42±0.03％。在體外釋放實驗中，與Taxol(@)比較，TPN表現(xiàn)出緩釋特性，釋放曲線符合Higuchi方程Q=8.0449t1/2-0.5721，R=0.9678。細(xì)胞毒性實驗結(jié)果表明，TPN的細(xì)胞毒性（IC50=0.392±0.012μM）顯著高于Taxol(@)（IC50=3.554±0.233μM）和PN（IC50=1.510±0.099μM）(P＜0.01)，具有良好的體外抗腫瘤活性。在

13、細(xì)胞攝取實驗中，F(xiàn)ITC標(biāo)記TPN的攝取具有時間依賴性和濃度依賴性，在不同濃度下，F(xiàn)ITC標(biāo)記TPN的攝取率顯著高于FITC標(biāo)記PN(P＜0.01)。在體內(nèi)腫瘤抑制實驗中，與NS、Taxol(@)、PN比較，TPN能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤體積的增長(P＜0.01)，TPN組生存時間（大于30d）長于Taxol(@)組(23d)和PN(27d)，具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。以上實驗結(jié)果表明TPN能夠?qū)崿F(xiàn)HCC的靶向治療，提高治療效果，具有重

14、要的應(yīng)用前景。
　　3.診斷治療學(xué)多功能納米粒的制備與表征
　　為實現(xiàn)HCC的Theranostics，需要在腫瘤靶向治療的基礎(chǔ)上添加實時診斷模式。課題基于功能集成組裝的思路，將Gd的MRI顯影模式添加至TPN中，制備TGPN用于HCC的Theranostics研究。利用自組裝方法制得TGPN外觀圓整，呈球形或類球形，粒徑為147.50±4.71nm，Zeta電位為24.45±1.04mv，包封率和載藥量分別為88.76±1

15、.64％和1.59±0.06％。在體外釋放實驗中，與Taxol(@)比較，TGPN表現(xiàn)出緩釋特性，釋放曲線符合Weibull方程lnln[1/(1-Q/100)]=0.696lnt-6.5891(R=0.9533)。在細(xì)胞毒性實驗中，TGPN在24h的細(xì)胞毒性高于Taxol(@)和GPN(P＜0.05)，具有良好的體外抗腫瘤活性。FITC標(biāo)記TGPN的細(xì)胞攝取具有時間依賴性和濃度依賴性，在AFP陽性HepG2細(xì)胞中，孵育0.5h后，F(xiàn)I

16、TC標(biāo)記TGPN的攝取率顯著高于FITC標(biāo)記GPN(P＜0.01)，在AFP陰性B16細(xì)胞中，F(xiàn)ITC標(biāo)記TGPN與FITC標(biāo)記GPN的攝取率之間沒有顯著性差異(P＞0.05)，證明AFP抗體能夠促進(jìn)TGPN在HepG2細(xì)胞中的攝取。體外MRI評價表明TGPN具有高弛豫率(25.388mM-1s-1)，是馬根維顯(@)(4.9mM-1s-1)的5.18倍。在體內(nèi)MRI實驗中，給藥TGPN后，小鼠腫瘤區(qū)域的顯影信號增強(qiáng)AUC值為馬根維顯(

17、@)的87.6倍，信號峰值為馬根維顯(@)的2.94倍，并能顯著延長診斷時間，從馬根維顯(@)的小于1h延長至6h以上，具有良好的體內(nèi)MRI診斷能力。與NS、Taxol(@)、比較，TGPN能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤體積的增長(P＜0.01)，TPN組生存時間(20d)長于Taxol(@)組(11d)和PN(15d)，具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。以上實驗結(jié)果表明TGPN具有優(yōu)秀的HCC診斷和治療能力，能夠?qū)崿F(xiàn)治療過程的實時檢測，從而利于實現(xiàn)

18、給藥個體化，具有重要的應(yīng)用潛力。
　　4.pH敏感診斷治療學(xué)多功能納米粒的制備與表征
　　腫瘤組織的定位釋藥策略能夠提高診斷治療學(xué)納米載體治療效果和診斷靈敏度，更有利于發(fā)揮Theranostics策略優(yōu)勢。因此，本文設(shè)計具有pH響應(yīng)性釋藥能力的Theranostics納米粒，制備TPTN用于HCC的診斷治療研究。首先建立索拉菲尼高效液相色譜檢測方法，索拉菲尼在選定的液相條件下峰型良好，符合方法學(xué)考察要求。利用自組裝方法制得T

19、PTN外觀圓整，呈球形或類球形，粒徑為181.4±3.4nm，Zeta電位為14.95±0.60mv，包封率和載藥量分別為95.02±1.47％和2.38±0.04％。在含10％血清條件下，TPTN在2～4h內(nèi)粒徑保持穩(wěn)定，證明穩(wěn)定性良好。在體外釋放實驗中，TPTN的釋放具有pH依賴性，其在pH=5.0的釋放介質(zhì)中釋放速率顯著高于pH=7.4的釋放介質(zhì)(P＜0.01)。在細(xì)胞毒性實驗中，TPTN在pH=5.0環(huán)境中孵育1h后的細(xì)胞毒性與

20、索拉菲尼溶液相當(dāng)，證明TPTN具有良好的體外抗腫瘤活性。FITC標(biāo)記TPTN的細(xì)胞攝取具有時間依賴性和濃度依賴性，在不同濃度下，F(xiàn)ITC標(biāo)記TPTN的攝取率顯著高于FITC標(biāo)記PTN(P＜0.01)。體外MRI評價表明TPTN具有高弛豫率(17.300mM-1s-1)，是馬根維顯(@)(4.9mM-1s-1)的3.53倍。腫瘤模型小鼠靜脈給藥TPTN后，小鼠腫瘤區(qū)域與周圍組織之間的信號對比明顯，肉眼可以觀察到明顯的腫瘤邊界，并能顯著延長

21、診斷時間，從馬根維顯(@)的小于1h延長至1.5h以上，具有良好的體內(nèi)MRI診斷能力。在體內(nèi)腫瘤抑制實驗中，與NS、索拉菲尼溶液（口服或靜注）、PTN比較，TPTN能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長(P＜0.01)，說明TPTN具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。通過組織免疫切片觀察，小鼠靜脈注射TBN后，各個臟器與注射生理鹽水組相應(yīng)臟器比較沒有明顯的組織毒性，證明TBN是一個相對安全的載體。以上實驗結(jié)果表明TPTN在具有優(yōu)秀的HCC診斷和治療能力的同