紅芝發(fā)酵產(chǎn)漆酶及其在染料脫色中的應(yīng)用研究.pdf

1、漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化還原酶,能夠催化多種化合物的氧化反應(yīng),具有廣泛的作用底物,包括:酚類、芳胺類、羧酸類、生物色素、金屬有機(jī)化合物和非酚類等物質(zhì)。在食品工業(yè)、造紙工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、生物檢測、有機(jī)合成和能源開發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本文是在實驗室前期研究的基礎(chǔ)上,對篩選獲得的一株組成型漆酶高產(chǎn)菌株紅芝的液態(tài)發(fā)酵條件、固態(tài)發(fā)酵條件、漆酶的酶學(xué)性質(zhì)及漆酶粗酶液在染料脫色中的應(yīng)用進(jìn)行了較為全面的研究

2、,研究結(jié)果如下:(1)紅芝產(chǎn)漆酶液態(tài)發(fā)酵條件研究通過單因素實驗及正交設(shè)計,對紅芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,紅芝液態(tài)搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)漆酶的適宜培養(yǎng)基組成為:蔗糖35 g/L、麥麩8g/L、硫酸銨6g/L、干酪素8g/L、CuSO4·5H2O0.02g/L、KH2PO43g/L、MgSO4·7H2O1.5g/L、VB110mg/L、VC500mg/L;適宜的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基初始pH值5.0,250mL三角瓶的裝液量80mL,接

3、種量3.75％(V:V),32℃,120r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72h,漆酶活力達(dá)到最高2126U/mL(底物:愈創(chuàng)木酚)。同時對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)程的研究發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)時間延長,培養(yǎng)基的pH值逐漸降低,達(dá)到最高酶活時培養(yǎng)基的pH值從5.0降為4.0,隨后pH值保持穩(wěn)定。(2)紅芝產(chǎn)漆酶固態(tài)發(fā)酵條件研究對紅芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行研究,結(jié)果表明:適宜固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為:以1.5:1甘蔗渣和麥麩為基質(zhì),葡萄糖0.5%、硫酸銨5%、C

4、uSO4·5H2O0.01%、培養(yǎng)基含水率73%。適宜固態(tài)培養(yǎng)條件為:初始pH值4.0,接種量20%(V:W),28℃靜置培養(yǎng)8d,酶活達(dá)到最高23803U/g。按上述的工藝條件,在聚丙烯塑料袋中進(jìn)行放大培養(yǎng),達(dá)到最高酶活的時間仍然是8d,而漆酶活力只有16087U/g。(3)紅芝組成型漆酶酶學(xué)性質(zhì)研究對紅芝組成型漆酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:該漆酶的最適作用溫度為60℃,最適pH值為3.0,在50℃以下和pH2.5-4.0范圍內(nèi)

5、較穩(wěn)定,Cu2+、Mn2+對酶活有較強(qiáng)的促進(jìn)作用,Cr3+、Hg2+、Fe2+對酶活有較強(qiáng)的抑制作用,其中Fe2+可使該漆酶完全失活;EDTA、DMSO、SDS對漆酶活力的抑制作用較大,使酶活力幾乎下降一半;以愈創(chuàng)木酚作為底物,在最適溫度和最適pH值條件下測得漆酶的表觀Km值為0.13mmol/L,最大反應(yīng)速率Vmax為234nmol/(mL·min)。(4)紅芝漆酶對染料脫色的應(yīng)用研究通過紅芝固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)生的漆酶粗酶液,對蒽醌染料活性

6、艷藍(lán)KN-R,偶氮染料甲基橙和三芳甲烷染料結(jié)晶紫進(jìn)行脫色實驗,結(jié)果表明:蒽醌染料活性艷藍(lán)KN-R可直接被該漆酶脫色,但脫色速率較低,反應(yīng)3h達(dá)到平衡,添加小分子介質(zhì)(ABTS)可明顯提高脫色速率,反應(yīng)60min即可達(dá)到平衡。偶氮染料甲基橙和三芳甲烷染料結(jié)晶紫不能直接被漆酶脫色,必須在反應(yīng)體系中添加小分子介質(zhì)。活性艷藍(lán)KN-R適宜脫色條件為:活性艷藍(lán)KN-R400mg/L, ABTS濃度10μmol/L,漆酶酶活30U/mL,pH4.0,

7、在30℃條件下作用60min,脫色率達(dá)91%。甲基橙適宜脫色條件為:甲基橙50mg/L,ABTS濃度10μmol/L,漆酶酶活30U/mL,pH3.5,在30℃條件下作用90min,脫色率為78%。結(jié)晶紫適宜脫色條件為:結(jié)晶紫50mg/L,ABTS濃度10μmol/L,漆酶酶活30U/mL,pH3.0,在30℃條件下作用180min,脫色率為85%。通過研究金屬離子對脫色率的影響發(fā)現(xiàn),Cu2+、Mn2+、Mg2+促進(jìn)漆酶對染料的脫色,提