豬克隆胚胎生產(chǎn)技術(shù)及組蛋白乙?；庖邿晒馊旧夹g(shù)優(yōu)化.pdf

1、豬的體細胞核移植（克?。┘夹g(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)、人類醫(yī)學、基礎(chǔ)研究等方面都有非常重要的應用價值。但是，目前豬的體細胞克隆操作要求復雜、效率低、成本高，極大地限制了該技術(shù)的推廣。為建立一種經(jīng)濟、有效、方便而穩(wěn)定的豬體細胞克隆胚生產(chǎn)技術(shù)體系，以及為將來揭示豬克隆胚胎發(fā)育表觀遺傳修飾調(diào)控機理研究奠定基礎(chǔ)。本研究開展了如下試驗：
　　 試驗一：探索了肺氣對豬卵母細胞體外成熟及后續(xù)孤雌和克隆胚胎早期發(fā)育能力的影響。豬卵母細胞隨機分布在三組氣相環(huán)

2、境下(lung air；5％O2;20％O2)，經(jīng)體外成熟后檢測其細胞核成熟情況及后續(xù)孤雌和克隆胚胎發(fā)育能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：使用肺氣成熟的豬卵母細胞在核成熟率(66.5％vs.60.2％，63.2％)及后續(xù)孤雌胚胎卵裂率(94.8％vs.94.2％，85.2％)、囊胚率(39.5％vs.40.3％，32.5％)、囊胚細胞總數(shù)(37vs.38，32)與低氧(5％O2)、高氧(20％O2)差異不顯著。此外，豬克隆胚胎卵裂率(88.3％vs.80

3、.3％)、囊胚率(7.3％vs．10.7％)和囊胚細胞數(shù)(34vs.36)與高氧(20％O2)也差異不顯著。結(jié)果表明：人體呼出的肺氣可以安全、有效地成熟豬卵母細胞。
　　 試驗二：比較了三組氣相環(huán)境下(5％O2;20％O2;lung air)培養(yǎng)豬無透明帶孤雌胚胎早期發(fā)育效率。豬卵母細胞透明帶經(jīng)消化去除后，施以43V，80μs，，1次的電激活后，將無透明帶的卵母細胞培養(yǎng)在WOW(wells of well，WOW)中，觀察其體外

4、發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：低氧(5％O2)和高氧(20％O2)之間的卵裂率、囊胚率、囊胚細胞數(shù)均差異不顯著，但囊胚率和囊胚細胞數(shù)明顯高于肺氣組(lung air)。結(jié)果表明：使用肺氣培養(yǎng)豬無透明帶孤雌激活胚胎可能沒有低氧(5％O2)和高氧(20％O2)效果好。
　　 試驗三：研究了化學半限定培養(yǎng)基和化學限定培養(yǎng)基對豬孤雌和克隆胚胎早期發(fā)育的影響。豬孤雌胚胎和克隆胚胎分別隨機分布在PZM-3、PZM-4、PZM-5三種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察

5、和分析其卵裂、囊胚和囊胚細胞數(shù)的情況。結(jié)果如下：對孤雌胚胎而言，三組培養(yǎng)基之間的卵裂率差異不顯著(P＞0.05)，PZM-3中囊胚率顯著高于PZM-4和PZM-5(78.9％vs.36.0％，52.3％)（P＜0.05），并且囊胚細胞數(shù)PZM-3組明顯高于PZM-5，但與PZM-4相似。就克隆胚胎而言，三組培養(yǎng)基之間的卵裂率和囊胚率均差異不顯著CP＞0.05），但囊胚細胞數(shù)PZM-3組明顯高于PZM-5，并且與PZM-4組相似。上述結(jié)果

6、表明：化學半限定培養(yǎng)基PZM-3和化學限定培養(yǎng)基PZM-4能夠有效地支持豬PA和SCNT胚胎的發(fā)育。
　　 試驗四：比較了不同融合激活方法對豬無透明帶克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響。豬無透明帶克隆胚胎經(jīng)一步法的融合同時激活方案和兩步法的融合后延遲激活方案，激活后培養(yǎng)于WOW中觀察兩種激活策略的克隆胚胎早期發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩種融合激活方案之間的卵裂率、囊胚率及囊胚細胞數(shù)均差異不顯著(P＞0.05)。但融合后延遲激活方案的囊胚率有高

7、于融合同時激活的趨勢。結(jié)果表明：融合同時激活和融合后延遲激活都能夠有效地激活豬克隆胚胎，但融合后延遲激活的效果更好些。
　　 試驗五：研究了不同卵胞質(zhì)數(shù)量對豬無透明帶克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響。將1枚卵胞質(zhì)和2枚卵胞質(zhì)構(gòu)建的無透明帶豬重構(gòu)胚，經(jīng)融合后延遲激活方案處理后培養(yǎng)于WOW中觀察和分析兩組的克隆胚胎早期發(fā)育能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩枚卵胞質(zhì)構(gòu)建的克隆胚胎在卵裂率(92.1％vs.74.8％)、囊胚率(21.5％vs．9.5％)及囊

8、胚細胞數(shù)(49vs.30)方面均顯著高于對照組1枚卵胞質(zhì)構(gòu)建的克隆胚胎(P＜0.05)。結(jié)果表明：增加去核卵細胞質(zhì)的數(shù)量或體積能夠提高豬克隆胚胎早期發(fā)育效率和囊胚發(fā)育質(zhì)量。
　　 試驗六：豬孤雌胚胎和胎兒成纖維細胞免疫熒光染色技術(shù)優(yōu)化研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：進口二抗、胚胎固定時間15min和透化時間20～30min，有透明帶可以明顯提高染色照片的清晰度并降低背景色。而不同代數(shù)豬胎兒成纖維細胞染色效果差異不明顯。結(jié)果表明：使用進口二抗、胚