PRRSV間接免疫熒光方法的建立及感染細胞過程中亞中和劑量抗體的介導作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病。該病已經引起世界各國的高度重視,相關研究也不斷展開,但是它的致病機理還不是很清楚。目前的一些研究發(fā)現(xiàn)PRRSV感染過程中存在抗體依賴性增強作用現(xiàn)象,亞中和劑量抗體能通過與靶細胞表面的Fc受體結合而增強病毒的感染,這可能與病毒的致病性相關。
　　 本試驗用PRRSV Hn/06毒株接種Marc-145細胞,

2、待出現(xiàn)病變后收集病毒液,滴鼻感染20日齡健康仔豬,10mL/頭,感染后第11天、21天、31天分別用含弗氏不完全佐劑的純化濃縮病毒抗原加強免疫,5mL/頭,感染后45天采血制備免疫血清,經ELISA方法檢測,抗體效價為1:12800,結果表明成功制備了豬抗PRRSV免疫血清。
　　 用硫酸銨鹽析法粗提健康豬IgG,經DEAE-纖維素離子交換層析柱純化,將純化豬IgG免疫兔子,制備兔抗豬免疫血清,經瓊脂擴散試驗測定,抗體效價為1:

3、64。用同樣的方法粗提并純化兔抗豬IgG后,測蛋白含量,濃縮后用低溫袋內標記方法標記FITC熒光素,在PBS液中透析4h后經葡聚糖凝膠層析柱去除游離的FITC分子,紫外分光光度計測定標記后的兔抗豬熒光二抗,濃度為6.99mg/mL。
　　 在24孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)Marc-145細胞,待其K到75％以上單層時接種PRRSV,培養(yǎng)48h后,用70％冷丙酮溶液固定,PBS液洗滌,將豬抗PRRSV陽性血清做一抗,分別作100、200、

4、400、800、1600和3200倍稀釋,用FITC標記的兔抗豬IgG做二抗,分別作10、20、30、40和50倍稀釋,同時設陰性血清對照。按照方陣法確定一抗和二抗的最佳。工作濃度分別為1:800和1:20。結果表明成功建立了可檢測PRRSV的間接免疫熒光方法(IFA)。
　　 將豬抗PRRSV免疫血清做1:2、1:4、1:8、1:16、1:32不同稀釋度,分別與等體積的200 TCID50的PRRSV病毒液作用1h后接種豬肺巨

5、噬細胞(PAM),培養(yǎng)48h后用IFA檢測PAM中PRRSV,測定免疫血清的中和效價為1:4。
　　 本試驗將1:8、1:16、1:32三個稀釋度的亞中和劑量免疫血清與等體積的200 TCID50的PRRSV病毒液作用1 h,制成不同濃度的抗體與病毒的復合物,然后和等體積的10倍稀釋的豚鼠血清作用1h后接種PAM細胞,培養(yǎng)48 h后用IFA檢測PAM細胞中PRRSV；同時將不同濃度的亞中和劑量抗體與病毒的復合物分別與等體積的10

6、倍稀釋的兔抗豬IgG作用1h后接種PAM細胞,培養(yǎng)48h后用IFA檢測PAM細胞中PRRSV,用PRRSV感染PAM細胞試驗作陽性對照。結果顯示,在補體受體阻斷和Fc受體阻斷試驗中,均沒有出現(xiàn)和感染對照試驗一樣的熒光,說明補體和兔抗豬IgG成功阻斷了亞中和劑量抗體與病毒的復合物進入PAM細胞。
　　 在24孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)PAM細胞,24 h后分別將鼠抗豬FcγRⅡB受體胞外區(qū)血清、鼠抗FcγRⅢ受體胞外區(qū)血清及其混合血清加入

7、PAM細胞,封閉1 h后接種不同濃度的亞中和劑量抗體與病毒的復合物,培養(yǎng)60h后用IFA和RT—PCR方法分別檢測PAM中的PRRSV。同時用健康鼠血清封閉PAM細胞作陰性對照,用PRRSV感染PAM細胞作陽性對照。結果顯示,鼠抗豬FcγRⅡB胞外區(qū)血清均能阻斷1:8、1:16和1:32稀釋的三個亞中和劑量抗體與病毒的復合物進入PAM細胞,而鼠抗FcγRⅢ胞外區(qū)血清只能夠阻斷1:8稀釋的亞中和劑量的抗體與病毒的復合物進入PAM細胞,兩種