養(yǎng)殖魚類病原菌檢測芯片技術(shù)的建立.pdf

1、水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類細菌性疾病頻繁爆發(fā)，危害極大，只有及時準確的診斷出病原才能進行有效的治療，保證魚類的健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展，因此，建立一種平行快速診斷方法至關(guān)重要。免疫芯片技術(shù)是一種新興的免疫學(xué)檢測技術(shù)，具有微量化、特異性強、敏感性高、樣品處理簡單、高通量平行分析等優(yōu)點，在人類疾病的病原檢測上已顯示出廣闊的應(yīng)用前景，但在魚類疾病病原檢測方面的應(yīng)用卻鮮有報道。本文以瓊脂糖修飾基片為載體，建立了兩套微陣列芯片檢測系統(tǒng)，包括檢測魚類病原菌的抗體微陣

2、列和檢測魚類病原菌抗體的抗原微陣列。
　　 選取海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)、熒光假單胞菌(Psedomonas fluorescens)及海分支桿菌(Mycobacterium marinum)等6種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類病原菌，確認其致病性后，制備全

3、菌兔抗血清；提取其中4種革蘭氏陰性菌的外膜蛋白，切取特異性條帶，制備特異蛋白條帶的兔抗血清。采用ELISA、Western-blot及Dot-blot分析了6種病原菌與各兔抗血清之間的免疫反應(yīng)，構(gòu)建了檢測6種病原菌的抗體微陣列，確定了芯片上抗體的最佳固定濃度、細菌孵育時間、標記抗體稀釋倍數(shù)，對各株細菌進行了檢測，并確定了其檢測限。另外，優(yōu)選各病原菌的特異性抗原，制備了檢測病原菌抗體的抗原微陣列。本文還將所制備的抗體芯片與抗原芯片應(yīng)用于人

4、工感染牙鲆(Paralichthys olivaceus)和天然患病紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)病原的診斷。具體實驗結(jié)果如下：
　　 (1)通過致病性實驗確認上述6株菌的半數(shù)致死量分別為7.94×105、6.31×105、1×106、7.94×105、1.26×107、2.51×107cfu/尾，具有較強的毒力。
　　 (2)提取遲緩愛德華氏菌、鰻弧菌、殺鮭氣單胞菌、熒光假單胞菌4種革蘭氏陰性菌的外膜

5、蛋白(OMP)，切取35kD遲緩愛德華氏菌OMP、38kD鰻弧菌OMP、42kD殺鮭氣單胞菌OMP、34kD和22kD熒光假單胞菌OMP，分別制備6種菌全菌及切取的OMP的兔抗血清，ELISA、Western-blot及Dot-blot分析6種魚類病原菌與兔抗血清之間的免疫反應(yīng)結(jié)果顯示，34kD熒光假單胞菌OMP兔抗血清與各菌有強烈交叉反應(yīng)，無法用于檢測；其余各抗血清與相應(yīng)的抗原菌株的反應(yīng)是最強烈的，可用于免疫診斷芯片的制備與抗原菌的檢

6、測。
　　 (3)將純化的各兔抗血清的濃度稀釋為3、2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL，每個濃度為一矩陣，每個矩陣內(nèi)以3×3形式點樣于芯片載體，結(jié)果顯示，芯片上捕獲抗體的最佳固定濃度為：海分支桿菌抗體為1.5 mg/mL，其余5株菌抗體為0.5mg/mL。將捕獲抗體在片基上以4×4形式點樣，細菌孵育時間設(shè)為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，結(jié)果顯示，海豚鏈球菌、鰻弧菌、熒光假單胞菌孵育1h，而遲緩愛德華

7、氏菌、殺鮭氣單胞菌和海分支桿菌孵育1.5 h時取得的信號值最高。檢測抗體稀釋倍數(shù)確定實驗發(fā)現(xiàn)標記抗海豚鏈球菌血清可稀釋2000倍使用，標記抗遲緩愛德華氏菌血清可稀釋6000倍使用，而標記鰻弧菌、殺鮭氣單胞菌、熒光假單胞菌、海分支桿菌抗血清可稀釋4000倍使用。
　　 (4)構(gòu)建了檢測6種病原菌的抗體芯片，第一種抗體芯片片基上固定的是各全菌抗血清，第二種抗體芯片片基上固定的抗體為海豚鏈球菌、海分支桿菌全菌抗血清及其余4種菌的OMP

8、抗血清。利用抗體芯片對6種病原菌進行檢測發(fā)現(xiàn)，使用酶標單一抗體對單株菌液進行檢測，當捕獲抗體為全菌抗血清時，可檢測出1010-103cfu/mL的海豚鏈球菌、鰻弧菌，1010-104cfu/mL的遲緩愛德華氏菌，109-103cfu/mL的殺鮭氣單胞菌、熒光假單胞菌、海分支桿菌；當捕獲抗體為OMP抗血清時，可檢出1010-103cfu/mL的海豚鏈球菌，1010-104fu/mL的遲緩愛德華氏菌，109-105 fu/mL的鰻弧菌、熒光

9、假單胞菌，109-103 cfu/mL的殺鮭氣單胞菌、海分支桿菌。單一檢測抗體對混合菌液進行檢測的結(jié)果顯示，濃度為1010-106cfu/mL混合菌液內(nèi)的海豚鏈球菌、海分支桿菌，109-105fu/mL混合菌液內(nèi)的遲緩愛德華氏菌、鰻弧菌，109-106cfu/mL的殺鮭氣單胞菌，1010-107cfu/mL混合菌液內(nèi)的熒光假單胞菌可被檢出。酶標混合抗體對單株菌液的檢測結(jié)果顯示，1010-104 cfu/mL的海豚鏈球菌、遲緩愛德華氏菌、

10、殺鮭氣單胞菌，1010-103 cfu/mL的鰻弧菌、熒光假單胞菌、海分支桿菌可被檢出。
　　 (5)分別提取了海豚鏈球菌的類M蛋白、莢膜多糖、胞外產(chǎn)物，4種革蘭氏陰性菌的外膜蛋白、胞外產(chǎn)物、鞭毛蛋白和海分支桿菌的細胞壁蛋白，并制備6種菌的全菌破碎液，分別稀釋為1 mg/mL，點在芯片載體上，根據(jù)是否與對應(yīng)菌免疫牙鲆產(chǎn)生的抗血清反應(yīng)篩選各菌的特異性抗原。用各菌特異性抗原構(gòu)建抗原芯片，檢測抗體水平變化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加強免疫后，檢測點顏

11、色逐漸加深，海豚鏈球菌免疫的牙鲆抗體在第四周時紫紅色最深，說明抗體水平達到峰值，其他菌株免疫的牙鲆則在第五周時抗體水平達到峰值，之后緩慢下降。將6種菌的所有抗原點到同一矩陣內(nèi)，構(gòu)建病原菌抗原芯片，通過檢測病原菌抗體以診斷病原，結(jié)果顯示，檢測注射無菌PBS的牙鲆抗血清時，除陽性對照點顯深紫紅色外，無其他任何反應(yīng)；當檢測樣品為海豚鏈球菌免疫牙鲆后的抗血清時，抗血清可與該菌所有抗原點反應(yīng)，而與其他菌的抗原點或無反應(yīng)，或顯色反應(yīng)較淺，由此判定牙

12、鲆已感染海豚鏈球菌；對其他5種菌免疫牙鲆后的抗血清進行檢測的結(jié)果也是如此，說明構(gòu)建的抗原芯片可以進行準確診斷。
　　 (6)將構(gòu)建的抗體芯片應(yīng)用于人工感染一種或多種病原菌的牙鲆的病原診斷，結(jié)果顯示，從單獨注射海豚鏈球菌液或遲緩愛德華氏菌液的牙鲆組織里可準確檢測出兩種菌；注射鰻弧菌、熒光假單胞菌和海分支桿菌混合液的牙鲆組織勻漿液，在使用單一檢測抗體時，可檢出相應(yīng)的病原菌，使用混合檢測抗體時可同時準確檢出3株菌；而抗體芯片對自然發(fā)病

13、紅鰭東方鲀進行檢測時發(fā)現(xiàn)在其膽汁中可檢測到海豚鏈球菌、鰻弧菌、殺鮭氣單胞菌與熒光假單胞菌。利用抗原芯片對人工感染后的牙鲆血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)芯片上海豚鏈球菌或遲緩愛德華氏菌的各抗原均被染色，判為海豚鏈球菌或遲緩愛德華氏菌檢測陽性；對患病紅鰭東方純及健康牙鲆血清的檢測，除陽性對照外，未發(fā)現(xiàn)有其他點顯色。ELISA對相同樣品的檢測得到了同樣的結(jié)果。
　　 病原菌檢測免疫芯片是對傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測手段的發(fā)展，本文構(gòu)建了檢測6種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類細