重慶地區(qū)羊傳染性膿皰與病原菌混合感染的檢測與分析

1、重慶地區(qū)羊傳染性膿皰與病原菌混合感染的檢測與分析許國洋1，付利芝1，徐登峰1，龍小飛2，陳朝洪2，李龍2，張素輝1（1.重慶市畜牧科學院，重慶榮昌402460，2.重慶市武隆區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶武隆408500）摘要：要：采集山羊口唇部痂皮，通過PCR檢測、MDBK細胞培養(yǎng)、電鏡觀察、間接免疫熒光（IFA）檢測對羊傳染性膿皰病毒進行系統(tǒng)鑒定，同時，分離培養(yǎng)病灶部位主要病原菌，進行分子鑒定、致病性和藥敏試驗檢測，初步分析病原特性。結(jié)果表明，

2、共分離到1株羊傳染性膿皰病毒，3種病原菌，通過對病原菌16SrDNA基因序列比對分析，發(fā)現(xiàn)其分別與多動物鏈球菌、金黃色葡萄球菌和溶血性曼氏桿菌同源性較高，在系統(tǒng)進化發(fā)育樹中分別與其聚為一簇。致病性分析，發(fā)現(xiàn)多動物鏈球菌和溶血性曼氏桿菌對小鼠的致死率高達100%。3種病原菌主要侵染部位為小鼠心臟、肝臟和肺臟，能夠引起肺臟和肝臟明顯病變。藥敏試驗表明，3種菌均對舒巴坦、阿米卡星和培氟沙星等6種藥物高度敏感。本研究首次從羊傳染性膿皰病變部位分

3、離到多動物鏈球菌、金黃色葡萄球菌和溶血性曼氏桿菌，為該病在重慶地區(qū)的流行特點和防治技術(shù)研究提供了理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：羊傳染性膿皰；病原菌；混合感染；多動物鏈球菌；金黃色葡萄球菌；溶血性曼氏桿菌中圖分類號：中圖分類號：S827；S855文獻標識碼文獻標識碼:ADetectionanalysisofmixedinfectionofcontagiousecthymapathogenicbacteriaingoatsofChongqing

4、XUGuoyang1FULizhi1XUDengfeng1LONGXiaofei2CHENChaohong2LILong2ZHANGSuhui1（1.ChongqingacademicofsciencetechenologyChongqing402460China2.WulongDistrictBureauofAnimalHusbryChongqing408500China）Abstract:PCRdetectionMDBKcellcu

5、ltureelectronmicroscopyindirectimmunofluescence(IFA)werecarriedoutfthesystematicidentificationofcontagiousecthymaingoats.Thepathogenswereisolatedculturedidentifiedbymolecularidentificationpathogenicanalysisdrugsensitivit

6、ytestatthesametime.Theresultshowedthatonevirusstrainthreekindsofpathogenicbacteriaweresuccessfullyisolated.ThepathogenicbacteriarespectivelywereStreptococcuspluranimaliumStaphylococcusaureusMannheimiahaemolyticaaccdingto

7、the16SrDNAidentification.eachpathogenicbacteriafmedaseparatewiththecrespondingstrainsaccdingtothesystemdevelopmentofthe羊傳染性膿皰（goatcontagiouspustulardermatitis）又稱羊口瘡，是由羊傳染性膿皰病毒引起的一種病毒性人畜共患病。羊傳染性膿皰病毒為雙鏈DNA病毒，屬于脊索動物痘病毒科副痘病毒

8、屬，該病毒易感動物為山羊和綿羊，主要引起羊只口唇、舌、乳房等部位出現(xiàn)膿皰和丘疹，后期形成痂皮，其被認為是20個感染山羊和綿羊最重要病毒性疾病之一，可對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重危害[12]。重慶地區(qū)因其獨特的地形地貌和濕熱氣候，導致羊只疫病種類日趨復雜，給疫病防控工作帶來巨大困擾，嚴重影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展。研究表明，羊傳染性膿皰可與病毒、支原體、衣原體等混合感染，因此，明確該病的病原，研究其混合感染情況對該病的致病機理研究和疫病防控十分關(guān)鍵[34]。通

9、過對重慶地區(qū)羊傳染性膿皰長期臨床診斷，我們發(fā)現(xiàn)該病發(fā)展與創(chuàng)口部位細菌的混合感染相關(guān)聯(lián)，關(guān)于該方面的報道相對較少，本研究針對羊傳染性膿皰混合感染的主要病原菌進行分離鑒定和致病性分析，為該病致病機理的進一步探索奠定基礎，也為該病的防控技術(shù)研發(fā)提供了理論依據(jù)。1材料與方法材料與方法1.1主要試劑主要試劑細菌及病毒基因組提取試劑盒、2TaqPCRMasterMix和DL2000Marker均由天根生化科技(北京)有限公司提供；參照張素輝[5]的

10、方法設計細菌16SrDNA基因序列通用引物FR，依據(jù)NCBI中公布的羊傳染性膿皰病毒F1L基因序列，設計特異性引物F1R1，引物由上海生物工程有限公司合成，引物信息見表1。表1引物序列信息引物序列信息名稱序列信息(53)產(chǎn)物大小bp細菌通用引物F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAGR:ACGGCTACCTTGTTACGACTT1500F1L基因序列引物F1：ATGGATCCACCCGAAATR1：TCACACGATGGCCGTGA

11、C7081.2試驗動物試驗動物SPF級健康昆明種小鼠，體質(zhì)量為18~25g，雌雄各半，購自西南大學榮昌校區(qū)；患病羊只為重慶某區(qū)縣養(yǎng)殖場羊傳染性膿皰疑似病例。1.3病毒的病毒的PCR鑒定鑒定利用病毒基因組提取試劑盒提取疑似病例口唇部痂皮組織基因組，進行羊傳染性膿皰病毒特異性序列PCR擴增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送往生工生物工程有限公司進行測序分析。1.4電鏡觀察及間接免疫熒光電鏡觀察及間接免疫熒光病毒接種單層MDBK細胞