哈銳炭疽菌轉(zhuǎn)錄組分析及其基因組DNA提取和測序.pdf

1、炭疽菌屬真菌是重要的植物病原菌，具有廣泛的寄主范圍。哈銳炭疽菌(C.horii)侵染柿樹，是柿樹上的一種毀滅性病害，給柿樹產(chǎn)業(yè)常帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。C.horii在侵染柿樹的過程中，具有活體和死體營養(yǎng)階段，在與寄主互作的活體階段形成界面基質(zhì)，界面基質(zhì)把真菌細(xì)胞壁和寄主的原生質(zhì)膜分開，這與活體營養(yǎng)型真菌與寄主的互作模式相類似?；铙w營養(yǎng)發(fā)展到一定階段后轉(zhuǎn)為死體營養(yǎng)階段，引起病害。哈銳炭疽菌與寄主的互作體系已成為研究真菌—寄主互作分子機(jī)制的重

2、要模式。隨著炭疽菌屬真菌C.higginsianum和C.graminicola基因組和轉(zhuǎn)錄組測序、注釋和分析完成，這些研究為揭示哈銳炭疽菌與寄主的互作機(jī)制提供了重要參考。本研究通過收集哈銳炭疽菌不同發(fā)育階段的樣品，提取RNA，純化mRNA后，建立cDNA文庫，純化擴(kuò)增后，運(yùn)用Illumina測序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測序。測序獲得的reads采用Trinity組裝、Blastx搜索和與同屬測序真菌C.higginsianum和C.gramin

3、icola的同源性分析等生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析。另外，本研究還對(duì)對(duì)測序基因組DNA的提取條件進(jìn)行了探究優(yōu)化。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1、通過轉(zhuǎn)錄組測序、組裝，獲得了41，492個(gè)高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本(平均長度991bps)，經(jīng)過去冗余后得到35，482個(gè)unigenes基因(平均長度796bps)。
　　2、通過同源性分析，對(duì)獲得的unigenes基因進(jìn)行注釋和評(píng)價(jià):(1)用BLASTx(E-value＜1.0E-5)程序，將u

4、nigenes與NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)中的 NR(non-redundant protein)、 Swiss-prot和KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)三個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，有21，079個(gè)unigenes匹配到NR庫中16，981個(gè)推測的基因通道號(hào)上，11，503個(gè)unigenes匹配到Swiss-pro

5、t庫的8，501個(gè)編碼蛋白的基因通道號(hào)上，6，101個(gè)unigenes匹配了KEGG庫中3，153個(gè)代謝途徑上的基因。(2)比較三個(gè)庫中匹配上的基因數(shù)量，三個(gè)庫中共享2，969個(gè)基因，其中，NR和Swiss-prot數(shù)據(jù)庫共享4，700個(gè)獨(dú)特的基因，Swiss-prot和KEGG數(shù)據(jù)庫共享184個(gè)獨(dú)特的基因，而NR和KEGG庫中無共有基因。
　　3、通過GO(Gene Ontology)分類分析，11，297個(gè)unigenes被指

6、派到GO的三大目錄上，即細(xì)胞組分、分子功能和生化過程。去冗余后，8，355個(gè)unigenes被指派到81，124個(gè)GO號(hào)上，這些GO號(hào)進(jìn)一步被指派到53個(gè)亞目錄中。4、C.horii與參考基因組比較:(1)建立本地Blast搜索，比較C.horii轉(zhuǎn)錄組的unigenes與同屬C.higginsianum和C.graminicola基因組中的基因關(guān)系。10，188個(gè)unigenes同源于7，932個(gè)C.graminicola的基因，10

7、，393個(gè)unigenes同源于C.higginsianum基因組7，411個(gè)基因，22，882個(gè)unigene無對(duì)應(yīng)的同源性基因。(2)用Blastp，在uniprot數(shù)據(jù)庫中搜索C.horii的unigenes、C.higginsianum和C.graminicola基因組注釋的蛋白。C.horii有12，719個(gè)unigenes匹配到8，506個(gè)已知蛋白序列上。比較三個(gè)種中已知蛋白數(shù)量關(guān)系，C.horii有4，016個(gè)獨(dú)特的蛋白，

8、三個(gè)種共享3，378個(gè)已知蛋白，C.horri與C.graminicola共享3，901個(gè)已知蛋白，與C.higginsianum共享3，967個(gè)已知蛋白。以上結(jié)果表明，C.horii含有更多的獨(dú)特基因。
　　另外，為了獲得滿足基因組測序建庫要求的DNA，還對(duì)基因組DNA的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。用C.horri，R.solani，P.drechsleri三種不同類型的真菌，從菌絲培養(yǎng)方法以及蛋白酶K和其它試劑進(jìn)行處理，結(jié)果表明，