過(guò)碘酸鈉氧化辣根過(guò)氧化物酶_hrp_中的若干問(wèn)題及高效果的標(biāo)記方法

1、第16卷第6期生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)1984年11月AOTABl(X)H工M工CAe七B工OPHYSICAS工NICAVol.16No.6Nov.1984過(guò)碘酸鈉氧化辣根過(guò)氧化物酶(HRP)中的若干問(wèn)題及高效果的標(biāo)記方法I五互宋光承陳彩云(中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)山心寄生蟲病研究所上海)摘要術(shù)文研究了過(guò)碘酸鈉氧化HRP的某些條件。戊二醛和磷酸鹽對(duì)酶有一定的影響而低濃度甲醛和醋酸鹽緩沖液(HAoB)則無(wú)明顯影響。氧化的最適pH在5.6左右。過(guò)碘酸鈉氧

2、化酶的適宜濃度在0.06~O015肛之間。氧化時(shí)間為10~30分鐘過(guò)長(zhǎng)則影響結(jié)合物效價(jià)。討論了加人乙二醇的必要性。醛化的HRP在pHg左右與抗體結(jié)合作用的適宜時(shí)間為16~24小時(shí)過(guò)長(zhǎng)則影響酶與抗體的活性過(guò)短則結(jié)合不夠完全。封閉結(jié)合物上多余醛基的KBH‘適宜量為0.1~0.219Ing酶。本法標(biāo)記抗體、抗原和葡萄球菌A蛋白的效果均較好方法簡(jiǎn)易標(biāo)記效果取決于酶是否能與抗體和抗原相結(jié)合以及標(biāo)記過(guò)程中酶和抗體活性是否受影響。用HRP標(biāo)記抗體或抗

3、原的方法基本上可分成2類。一類系用雙功能基團(tuán)的化合物使酶與抗體隨機(jī)偶聯(lián)如戊二醛一步法〔習(xí)。由于酶分子上游離氨基極少而抗體分子上氨基則相對(duì)地多為了彌補(bǔ)這一缺陷往往采用8~12個(gè)酶分子與1個(gè)抗體分子的比值進(jìn)行調(diào)整。戊二醛二步法的原理主要是HRP的氨基極少而加入的戊二醛分子數(shù)相對(duì)地多當(dāng)戊二醛中的一個(gè)醛基與酶分子上的一個(gè)氨基結(jié)合后則余下的一個(gè)醛基再與另一酶分子上的氨基作用的可能性極少故很少產(chǎn)生酶與酶間的偶聯(lián)。當(dāng)去除未作用的戊二醛后已醛化的酶與抗

4、體作用而成為結(jié)合物〔幻但這一方法標(biāo)記效果也并不理想。另一類系用過(guò)碘酸鈉氧化酶分子中的含糖部分使酶本身產(chǎn)生多個(gè)醛基酶的活性中心未受影響或影響不大而醛化了的酶再與待標(biāo)記物作用即可獲得結(jié)合物。這一方法由Nakane等首創(chuàng)〔3其特點(diǎn)是標(biāo)記效果高而所得的結(jié)合物分子量較大。上述方法除標(biāo)記效果較差的戊二醛一步法外操作均較復(fù)雜。駱加里等(198勸〔4J報(bào)道了HRP標(biāo)記抗原和抗體的簡(jiǎn)易方法并將戊二醛二步法與過(guò)碘酸鈉法結(jié)合起來(lái)試圖獲得更好的標(biāo)記效果但結(jié)果表

5、明戊二醛一過(guò)碘酸鈉法不如甲醛一過(guò)碘酸鈉法好。為了闡明這一原因并進(jìn)一步提高標(biāo)記效果探討了過(guò)碘酸鈉在氧化HRP時(shí)的若干條件及結(jié)合中的某些問(wèn)題并在這一基礎(chǔ)上建立了簡(jiǎn)易、穩(wěn)定、高效的方法。材料和方法HRP東風(fēng)生化試劑廠1976年產(chǎn)品RZ一2.78SigmaV工RZ一3.1或用戊二不文195昌年9月2盛日收到?！氨卷?xiàng)研究得到聯(lián)合國(guó)開發(fā)計(jì)劃署世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病、帶病研究培訓(xùn)特別規(guī)劃的部分文持。絲蟲病合作中J時(shí)世界銀行世界衛(wèi)生組織熱生物化學(xué)與

6、生物物理學(xué)報(bào)16卷Na1O濃度降低時(shí)的氧化效果進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):將酶溶于不同緩沖液中使成10mgml的濃度每1一種酶溶液又各等分為2加等量0.06萬(wàn)NaIO‘溶液者為A組加等量o03MNaIO‘溶液者為B組。兩組于4oC氧化30分鐘以后各步均按一般標(biāo)記法進(jìn)行并紀(jì)錄實(shí)驗(yàn)中的顯色情況和pH結(jié)果見表lo表l岡川04于不同p日緩沖液中氧化日Rp的情況實(shí)驗(yàn)階段組別測(cè)定和溶解酶的0.2叮溶液及反應(yīng)結(jié)果觀察內(nèi)容NaHP(〕4HAcBPHS.6汪AcBp

7、H4.6HAcBPH3.6水熔解酶后的溶液PH455.往1.23.051液色橙橙橙橙橙加入NaIO4溶液氧化A液色黃灰綠橙灰綠灰綠灰綠灰綠10~30分鐘后的溶液B液色黃橙微橙灰綠淡橙灰綠微橙灰綠橙灰綠刀日乙二醇一NaCI溶液后八pH生.15.23.92.64.9氧化10~30分鐘的溶液B液色橙黃橙橙稍淡淡橙橙PH4.15.24.12.751液色橙黃橙橙稍淡淡橙登加水溶解乙醇沉淀物后APH5.45.15.14.85.1的溶液B液色近無(wú)色橙

8、橙稍淡淡橙橙PH5454545.05.1液色近無(wú)色橙橙稍淡淡橙橙結(jié)合物A效價(jià)幸6~7十54~56B效價(jià)75十56十為了確定最適pH將酶分別溶于O.ZMpH6.O的rB、0.2MpH5.6的HAeB、O.ZM醋酸鈉(NaAe)及水測(cè)得的pH分別為:5.6、6.6、6.6及5.0。再加等量0.06萬(wàn)的N叔O水溶液氧化其余條件同一般標(biāo)記法。測(cè)得的各結(jié)合物效價(jià)分別為:3、7~8、7~8十及7。說(shuō)明除用PB作溶劑效果較差外其余三者差別不大。三、N

9、aIO氧化的適宜濃度將10mgml濃度的酶的水溶液加等量的0.12萬(wàn)、0.06萬(wàn)、o.o3M、o.01M及0.o1MN缸O溶液。其效價(jià)分別為7、7斗一、7十、5及1。四、NaIO氧化的適宜時(shí)間將酶分別溶于水或O.ZMpHS.6的HAcB或0.腸萬(wàn)NaAc中各加等量O.06MNa1O4分別氧化10、15、30分鐘或1小時(shí)。凡氧化10~30分鐘者除以水作溶劑的為7十外其余均為8。氧化1小時(shí)者結(jié)合物效價(jià)均相對(duì)地降低。五、抗體與醛化酶結(jié)合的適宜