氟蟲腈對PC12細胞毒作用及其機制的初步探討.pdf

1、近年來，我國農(nóng)藥使用量有增無減。隨著2007年甲胺磷等高毒的農(nóng)藥被全面禁用，中等毒性的新型農(nóng)藥使用量均大幅上升，如氟蟲腈在我國中部地區(qū)的使用量已經(jīng)明顯增多。氟蟲腈，商品名為銳勁特，屬于苯基吡唑類殺蟲劑，與吡啶類殺蟲劑相比，氟化苯基吡唑類農(nóng)藥殺蟲機制獨特，具有殺蟲譜廣的優(yōu)點，并且對有機磷、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥有抗藥性的害蟲毒性效果更為明顯。氟蟲腈作為一種中等毒性殺蟲劑，生物活性很高，是一種高效農(nóng)藥，對害蟲具有胃毒、觸殺和內(nèi)吸作用

2、，并且有效劑量與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥相當，其作用機制在于干擾昆蟲γ－氨基丁酸控制的氯化物代謝，致使昆蟲神經(jīng)痙攣、麻痹致死。國際上喻其為新一代高科技殺蟲劑，是第3 代新煙堿農(nóng)藥。但氟蟲腈作為一種新型農(nóng)藥，也具有其致命的缺點，即氟蟲腈具有較高的生態(tài)毒性，特別是對蜜蜂和水生生物（如蝦、蟹）的毒性高，因此不宜在蜜蜂和蝦蟹養(yǎng)殖地區(qū)使用。
　　 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一種重要的氧自由基，主要包括過氧化

3、氫和超氧化物陰離子。在生理條件下，機體內(nèi)的自由基處于平衡狀態(tài)，濃度很低，不僅不會對機體造成損傷，而且還具有重要的生理功能。但是，當環(huán)境中的物理因素或外源化學(xué)物質(zhì)直接或間接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了大量自由基，并且超過了機體的清除能力，或內(nèi)源性自由基產(chǎn)生和清除失去平衡，就會使機體處于氧化應(yīng)激（oxidative stress）狀態(tài)，進而使機體受到損害?；钚匝跖cCa2+濃度、調(diào)控蛋白Bcl-2含量等相關(guān)，并和它們一起影響著細胞凋亡。
　　 凋亡

4、蛋白Bcl-2是原癌基因Bcl-2表達的一種蛋白質(zhì)，對細胞凋亡的發(fā)生具有抑制作用。Bcl-2 蛋白抑制細胞凋亡的機制目前仍然不是很清楚，但大多認為與Bcl-2 蛋白具有的細胞內(nèi)抗氧化作用以及對鈣離子跨膜運動功能的抑制作用有關(guān)。
　　 本研究以大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞（PC12細胞）為模型，研究ROS和Bcl-2 蛋白在氟蟲腈對細胞毒作用中的含量變化，為了解氟蟲腈對體外培養(yǎng)細胞的毒作用機制提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　

5、　 實驗分組為對照和7.81×10-7、3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 四個劑量組，研究方法與內(nèi)容如下：
　　 1. MTT法測定以上四個劑量組作用12h、24h和48h后對PC12細胞存活率的影響；
　　 2.形態(tài)學(xué)方法檢測3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三個劑量組對PC12細胞凋亡與壞死的影響；
　　 3. 流式細胞術(shù)法測定3.13

6、×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三個劑量組對PC12細胞凋亡率的影響；
　　 4.免疫熒光細胞化學(xué)法測定3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三個劑量組作用PC12細胞24h后對Bcl-2 蛋白含量的影響；
　　 5. 比色法測定3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三個劑量組作用PC12細胞4h、8h、16h、24h對ROS含

7、量的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.對細胞存活率影響的研究結(jié)果表明，四個劑量組在作用PC12細胞12h 均無明顯毒性作用，作用24h和48h后各組細胞存活率即明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2. Hoechst-PI 雙參數(shù)法對細胞凋亡進行檢測，熒光顯微鏡下觀察到3.13×10-6mol/L 劑量組凋亡細胞數(shù)明顯多于對照組，而5.00×10-5mol/L 劑量組死亡細胞數(shù)明顯高于對照組。
　　

8、3. 流式細胞儀對不同劑量組細胞凋亡率及死亡率進行檢測。5.00×10-5mol/L 劑量組細胞死亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；3.13×10-6mol/L 劑量組細胞凋亡率明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.免疫熒光細胞化學(xué)法測定PC12細胞Bcl-2 蛋白表達，通過熒光顯微鏡對不同染毒劑量組進行熒光強度檢測，3.13×10-6mol/L 劑量組熒光強度明顯低于對照組。
　　 5.對不同劑量組染毒4h

9、、8h、16h和24h后，分別對各組細胞內(nèi)ROS含量進行檢測。3.13×10-6mol/L 劑量組在染毒4h后ROS含量明顯升高，較對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而5.00×10-5mol/L 劑量組在染毒24h后ROS含量明顯下降，較對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 氟蟲腈是一種中等毒性的農(nóng)藥，具有神經(jīng)毒性作用，它能夠使體外培養(yǎng)的PC12細胞存活率下降。在低劑量通過影響B(tài)cl-2 蛋白表達，使細胞內(nèi)ROS含量升高