氟蟲(chóng)腈對(duì)PC12細(xì)胞毒作用及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、近年來(lái)，我國(guó)農(nóng)藥使用量有增無(wú)減。隨著2007年甲胺磷等高毒的農(nóng)藥被全面禁用，中等毒性的新型農(nóng)藥使用量均大幅上升，如氟蟲(chóng)腈在我國(guó)中部地區(qū)的使用量已經(jīng)明顯增多。氟蟲(chóng)腈，商品名為銳勁特，屬于苯基吡唑類殺蟲(chóng)劑，與吡啶類殺蟲(chóng)劑相比，氟化苯基吡唑類農(nóng)藥殺蟲(chóng)機(jī)制獨(dú)特，具有殺蟲(chóng)譜廣的優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)有機(jī)磷、氨基甲酸酯類、擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥有抗藥性的害蟲(chóng)毒性效果更為明顯。氟蟲(chóng)腈作為一種中等毒性殺蟲(chóng)劑，生物活性很高，是一種高效農(nóng)藥，對(duì)害蟲(chóng)具有胃毒、觸殺和內(nèi)吸作用

2、，并且有效劑量與擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥相當(dāng)，其作用機(jī)制在于干擾昆蟲(chóng)γ－氨基丁酸控制的氯化物代謝，致使昆蟲(chóng)神經(jīng)痙攣、麻痹致死。國(guó)際上喻其為新一代高科技?xì)⑾x(chóng)劑，是第3 代新煙堿農(nóng)藥。但氟蟲(chóng)腈作為一種新型農(nóng)藥，也具有其致命的缺點(diǎn)，即氟蟲(chóng)腈具有較高的生態(tài)毒性，特別是對(duì)蜜蜂和水生生物（如蝦、蟹）的毒性高，因此不宜在蜜蜂和蝦蟹養(yǎng)殖地區(qū)使用。
　　 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一種重要的氧自由基，主要包括過(guò)氧化

3、氫和超氧化物陰離子。在生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)的自由基處于平衡狀態(tài)，濃度很低，不僅不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，而且還具有重要的生理功能。但是，當(dāng)環(huán)境中的物理因素或外源化學(xué)物質(zhì)直接或間接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了大量自由基，并且超過(guò)了機(jī)體的清除能力，或內(nèi)源性自由基產(chǎn)生和清除失去平衡，就會(huì)使機(jī)體處于氧化應(yīng)激（oxidative stress）狀態(tài)，進(jìn)而使機(jī)體受到損害。活性氧與Ca2+濃度、調(diào)控蛋白Bcl-2含量等相關(guān)，并和它們一起影響著細(xì)胞凋亡。
　　 凋亡

4、蛋白Bcl-2是原癌基因Bcl-2表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有抑制作用。Bcl-2 蛋白抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前仍然不是很清楚，但大多認(rèn)為與Bcl-2 蛋白具有的細(xì)胞內(nèi)抗氧化作用以及對(duì)鈣離子跨膜運(yùn)動(dòng)功能的抑制作用有關(guān)。
　　 本研究以大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞）為模型，研究ROS和Bcl-2 蛋白在氟蟲(chóng)腈對(duì)細(xì)胞毒作用中的含量變化，為了解氟蟲(chóng)腈對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的毒作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　

5、　 實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照和7.81×10-7、3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 四個(gè)劑量組，研究方法與內(nèi)容如下：
　　 1. MTT法測(cè)定以上四個(gè)劑量組作用12h、24h和48h后對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響；
　　 2.形態(tài)學(xué)方法檢測(cè)3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三個(gè)劑量組對(duì)PC12細(xì)胞凋亡與壞死的影響；
　　 3. 流式細(xì)胞術(shù)法測(cè)定3.13

6、×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三個(gè)劑量組對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率的影響；
　　 4.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三個(gè)劑量組作用PC12細(xì)胞24h后對(duì)Bcl-2 蛋白含量的影響；
　　 5. 比色法測(cè)定3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三個(gè)劑量組作用PC12細(xì)胞4h、8h、16h、24h對(duì)ROS含

7、量的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.對(duì)細(xì)胞存活率影響的研究結(jié)果表明，四個(gè)劑量組在作用PC12細(xì)胞12h 均無(wú)明顯毒性作用，作用24h和48h后各組細(xì)胞存活率即明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2. Hoechst-PI 雙參數(shù)法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，熒光顯微鏡下觀察到3.13×10-6mol/L 劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，而5.00×10-5mol/L 劑量組死亡細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組。
　　

8、3. 流式細(xì)胞儀對(duì)不同劑量組細(xì)胞凋亡率及死亡率進(jìn)行檢測(cè)。5.00×10-5mol/L 劑量組細(xì)胞死亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3.13×10-6mol/L 劑量組細(xì)胞凋亡率明顯多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定PC12細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)，通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)不同染毒劑量組進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，3.13×10-6mol/L 劑量組熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組。
　　 5.對(duì)不同劑量組染毒4h

9、、8h、16h和24h后，分別對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量進(jìn)行檢測(cè)。3.13×10-6mol/L 劑量組在染毒4h后ROS含量明顯升高，較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而5.00×10-5mol/L 劑量組在染毒24h后ROS含量明顯下降，較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 氟蟲(chóng)腈是一種中等毒性的農(nóng)藥，具有神經(jīng)毒性作用，它能夠使體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞存活率下降。在低劑量通過(guò)影響B(tài)cl-2 蛋白表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高