家蠶Sox基因鑒定和功能研究.pdf

1、Sox基因家族是一類只在動(dòng)物個(gè)體中存在的與動(dòng)物性別決定基因Sry(sex determiningregion of Y chromosome)具有高度序列相似性的轉(zhuǎn)錄因子家族，含有一個(gè)高度保守的與DNA結(jié)合相關(guān)的高遷移率族盒(high mobility group box，HMG-box)結(jié)構(gòu)域。最近，小鼠、果蠅等模式生物中的大量研究表明，Sox基因主要參與調(diào)節(jié)動(dòng)物性別分化及生殖腺發(fā)育、早期胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及軟骨和多種組織器官的

2、形成等多種生物學(xué)過程。
　　 家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是鱗翅目昆蟲研究的模式生物。家蠶胚胎發(fā)育、性別決定以及部分組織器官(如絲腺、生殖腺和脂肪體)的分化發(fā)育是家蠶生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域。Sox基因家族應(yīng)該可以成為研究這些家蠶生物學(xué)問題的靶標(biāo)之一，相關(guān)研究成果不僅可以用來改良家蠶性狀，也可以為鱗翅目害蟲的生物防治提供理論依據(jù)和關(guān)鍵作用靶標(biāo)。
　　 借鑒果蠅和其它物種中Sox基因的研究成果，利用家蠶基因組精細(xì)圖和基因芯片等數(shù)據(jù)

3、資源，我們對(duì)家蠶Sox基因進(jìn)行了鑒定，調(diào)查了Sox基因的時(shí)空表達(dá)譜，并在細(xì)胞水平和個(gè)體水平分析了SoxE基因的功能。獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.家蠶Sox基因的基因組水平鑒定及表達(dá)模式分析
　　 利用Sox蛋白保守的HMG盒(HMG box)結(jié)構(gòu)域序列來對(duì)家蠶基因組序列進(jìn)行同源性檢索，最后在家蠶基因組中鑒定獲得了9個(gè)Sox基因，分屬5個(gè)亞族，其中B族Sox基因包含5個(gè)成員，C、D、E、F族各有1個(gè)成員。利用家蠶S

4、NP分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，我們將所鑒定的所有家蠶Sox基因都定位到了染色體上。其中，B族的5個(gè)成員，即BmSox21a、BmSoxB3、BmDichaete、BmSox21b和BmSoxNeuro都位于4號(hào)染色體上，而且BmSox21a、BmSoxB3、BmDichaete和BmSox21b串聯(lián)排列在scaf2589重疊群的268 kb區(qū)域內(nèi)，與其它昆蟲B族Sox基因的染色體分布特征類似；其它Sox基因散在地分布在不同的染色體上。進(jìn)一步

5、對(duì)家蠶Sox基因完整HMG盒中的內(nèi)含子數(shù)目進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，家蠶有5個(gè)Sox基因的HMG盒沒有內(nèi)含子，包括BmSoxC、BmSoxD以及BmSox21a、BmSoxB3和BmDichaete等3個(gè)B族成員；B族BmSoxNeuro基因的HMG盒中有2個(gè)內(nèi)含子；BmSoxE的HMG盒中只含1個(gè)內(nèi)含子。
　　 調(diào)查40個(gè)不同地理分布的家蠶和野桑蠶個(gè)體基因組中Sox基因內(nèi)的SNP數(shù)量發(fā)現(xiàn)，家蠶群體內(nèi)每個(gè)Sox基因中的SNP數(shù)量為4～32個(gè)

6、，而野桑蠶群體內(nèi)每個(gè)Sox基因中的SNP數(shù)量為5～26個(gè)。對(duì)同一個(gè)Sox基因而言，其SNP數(shù)目在家蠶和野桑蠶群體中比較相近。如果同時(shí)比較40個(gè)蠶的基因組序列，可以發(fā)現(xiàn)每個(gè)Sox基因在40個(gè)蠶基因組中的SNP數(shù)量與此近似，從6至33個(gè)不等。SoxB3、Dichaete、SoxC和SoxD中的SNP頻率較高，而Sox21a、Sox21b、SoxB3、Dichaete、SoxE和Sox F等6個(gè)基因編碼區(qū)的部分SNP可導(dǎo)致非同義替換，但只有S

7、ox21a、SoxE和SoxF等3個(gè)基因中分別有1個(gè)SNP位點(diǎn)位于HMG盒。另外，應(yīng)用PAML程序包分析家蠶和野桑蠶Sox基因中的SNP數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，SoxB3和SoxD在家蠶馴化過程中受到了正選擇壓力。
　　 基于家蠶及其它昆蟲Sox蛋白HMG-box序列的多序列比對(duì)結(jié)果，我們構(gòu)建了家蠶及其它昆蟲Sox基因的系統(tǒng)發(fā)生樹，并發(fā)現(xiàn)所有昆蟲的SoxC、SoxD和SoxF三個(gè)族都能很好地各自聚成1個(gè)分支，而B族(Dichaete、Sox2

8、1a、Sox21b、SoxB1、SoxB2和SoxB3)及E族(SoxE1和SoxE2)各個(gè)成員之間的聚類較差。綜合分析基因數(shù)量、染色體分布、HMG盒中的內(nèi)含子數(shù)以及系統(tǒng)發(fā)生樹，推測(cè)家蠶及其它昆蟲中SoxC、SoxD和SoxF起源于昆蟲分化之前，B族和E族Sox基因的復(fù)制分化是在昆蟲相互分化之后發(fā)生的。
　　 利用RT-PCR檢測(cè)S似基因在家蠶胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，BmSox21a、BmSox21b、BmDichaete

9、、BmSoxNeuro、BmSoxC和BmSoxF等6個(gè)基因在家蠶整個(gè)胚胎發(fā)育期都有表達(dá)，只是表達(dá)量有差異。其中，BmSox21a在產(chǎn)卵后120小時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)，BmSoxB3從產(chǎn)卵后144小時(shí)開始表達(dá)并一直持續(xù)到蟻蠶，BmSoxE從產(chǎn)卵后72小時(shí)開始表達(dá)并持續(xù)到產(chǎn)卵后216小時(shí)。由于家蠶大量組織器官主要在胚胎發(fā)育后期形成，我們推測(cè)胚胎發(fā)育后期上調(diào)表達(dá)的BmSox21a、BmSoxB3和BmSoxE可能與家蠶幼蟲組織器官的形成相關(guān)。

10、r>　　 通過分析家蠶幼蟲5齡第3天各組織全基因組表達(dá)的芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，只有BmSoxE基因在幼蟲5齡第3天的卵巢和精巢中有表達(dá)，其它Sox基因在所有組織中都未檢測(cè)到表達(dá)，暗示BmSoxE基因參與了家蠶生殖腺發(fā)育的調(diào)控。分析家蠶幼蟲-蛹-成蟲變態(tài)發(fā)育過程的全基因組表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)只有4個(gè)Sox基因在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中有表達(dá)，包括BmSoxB3、BmSoxNeuro、BmSoxC和BmSoxE。其中，BmSoxB3在上蔟后216小時(shí)

11、的雄蛹及雄蛾中表達(dá)，BmSoxC在剛化蛹的雄蛹中表達(dá)，BmSoxNeuro和BmSoxE均在上蔟后96小時(shí)、144小時(shí)、168d小時(shí)、216小時(shí)、240小時(shí)的雄蛹及雄蛾中表達(dá)。但是，BmSoxNeuro還在化蛹前后表達(dá)，即在上蔟后36小時(shí)、48小時(shí)和60小時(shí)的雄個(gè)體及上蔟后48小時(shí)和60小時(shí)的雌個(gè)體中表達(dá)。綜合來看，Sox基因主要在家蠶變態(tài)發(fā)育的后期表達(dá)，推測(cè)其可能與家蠶蛹向成蟲的轉(zhuǎn)變調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　 2.家蠶BmSoxE基因的

12、全長(zhǎng)cDNA克隆及表達(dá)分析
　　 我們利用RACE技術(shù)對(duì)BmSoxE基因的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行了克隆。結(jié)果顯示，BmSoxE基因的完整cDNA序列全長(zhǎng)為1398 bp，編碼222個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，BmSoxE蛋白的氨基酸序列含有Sox蛋白家族典型的SOX-TCF_HMG-box結(jié)構(gòu)域(48～116 aa)和數(shù)個(gè)磷酸化位點(diǎn)。
　　 我們對(duì)BmSoxE基因的組織和時(shí)期表達(dá)譜進(jìn)行了分析。組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，BmSo

13、xE基因在家蠶幼蟲5齡第3天精巢中的表達(dá)量最高，在卵巢中的表達(dá)量次之。時(shí)期表達(dá)譜分析表明，從家蠶的幼蟲期一直到成蟲期，BmSoxE基因的表達(dá)一直維持在較高水平。分析BmSoxE基因在變態(tài)發(fā)育過程中不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的精巢和卵巢中的表達(dá)譜顯示，BmSoxE基因在精巢和卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)存在差異，特別是在預(yù)蛹前后，BmSoxE基因在幼蟲5齡第6天到上蔟后48小時(shí)的精巢中下調(diào)表達(dá)，但在同時(shí)期的卵巢中開始上調(diào)表達(dá)，推測(cè)BmSoxE在家蠶胚胎發(fā)育早

14、期即開始發(fā)揮作用，并在預(yù)蛹前后的精巢和卵巢的發(fā)育中發(fā)揮了不同的功能。我們制備了家蠶BmSoxE蛋白的抗體，對(duì)BmSoxE蛋白在雄蛾精巢中的表達(dá)分布進(jìn)行了免疫熒光組化分析。結(jié)果表明，BmSoxE蛋白只在雄蛾精巢部分細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。
　　 3.BmSoxE基因在家蠶BmN4細(xì)胞中的功能研究
　　 將表達(dá)Venus熒光蛋白融合的BmSoxE基因質(zhì)粒及其對(duì)照Dest質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到BmN4細(xì)胞中，并在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)再向培養(yǎng)基中

15、加入Hoechst溶液，對(duì)核DNA進(jìn)行染色，之后觀察并發(fā)現(xiàn)Venus融合的BmSoxE基因的表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核中。
　　 我們合成了目標(biāo)基因BmSoxE和對(duì)照基因EGFP的dsRNA，即dsBmSoxE和dsEGFP，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)7天后再分別收集BmN4-SID1細(xì)胞，以期在細(xì)胞水平開展BmSoxE基因的RNAi研究。我們首先發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，在dsBmSoxE處理的BmN4-SID1細(xì)胞中，BmSoxE基因的

16、表達(dá)明顯被下調(diào)，幾乎不能被檢測(cè)到，表明該RNAi技術(shù)體系可以用于BmSoxE基因的功能研究。
　　 用顯微鏡觀察dsBmSoxE和dsEGFP處理7天后的BmN4-SID1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)dsBmSoxE處理后的細(xì)胞數(shù)量明顯少于dsEGFP處理后的細(xì)胞。細(xì)胞增殖曲線分析表明，BmSoxE基因的RNAi會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生明顯的影響。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BmSoxE基因RNAi后，G2期和M期的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞主要滯留于細(xì)胞周期的

17、G1/S期。這表明BmSoxE基因在細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)化過程中具有重要的作用。
　　 我們進(jìn)一步用家蠶全基因組表達(dá)芯片對(duì)BmSoxE基因RNAi對(duì)BmN4-SID1細(xì)胞中基因表達(dá)的影響進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，BmSoxE基因RNAi后，BmN4-SID1細(xì)胞中有371個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了變化，其中142個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，227個(gè)基因上調(diào)表達(dá)；差異表達(dá)基因中有233個(gè)基因(91個(gè)下調(diào)表達(dá)基因和142個(gè)上調(diào)表達(dá)基因)有同源功能注釋

18、，157個(gè)基因(66個(gè)下調(diào)表達(dá)基因和91個(gè)上調(diào)表達(dá)基因)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的區(qū)域內(nèi)含有Sox蛋白HMG盒的識(shí)別位點(diǎn)。GO功能分析顯示，BmSoxE基因RNAi后的差異表達(dá)基因主要具有催化和結(jié)合活性，參與了發(fā)育、代謝、著色等生物學(xué)過程，部分特異的下調(diào)和上調(diào)表達(dá)基因以及表達(dá)變化超過10倍的基因大部分與細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、細(xì)胞分化等細(xì)胞命運(yùn)決定事件緊密關(guān)聯(lián)。
　　 另外，我們發(fā)現(xiàn)在BmN4細(xì)胞中過表達(dá)BmSoxE基因?qū)?xì)胞

19、增殖的促進(jìn)作用較小?；谌诤媳磉_(dá)標(biāo)簽的Western雜交檢測(cè)分析顯示，過表達(dá)的BmSoxE基因在BmN4細(xì)胞中具有蛋白表達(dá)。
　　 4.BmSox-E基因在家蠶個(gè)體中的功能初探
　　 考慮到BmSoxE基因在家蠶雄性個(gè)體生殖腺即精巢中的表達(dá)量較高，我們進(jìn)一步基于dsRNA介導(dǎo)的RNAi實(shí)驗(yàn)，對(duì)BmSoxE基因在家蠶雄性個(gè)體中的功能進(jìn)行了研究。在家蠶預(yù)蛹及化蛹后2天連續(xù)分別注射BmSoxE(試驗(yàn)組)和紅色熒光蛋白基因Red

20、(對(duì)照組)的dsRNA，即dsBmSoxE和dsRed。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是注射40μg/頭還是60μg/頭的dsRNA，試驗(yàn)組和對(duì)照組的家蠶都可以正常地化蛹和化蛾，且都能與正常雌蛾交配。但是，觀察交配后的雌蛾所產(chǎn)的卵發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組(注射dsRed)在48小時(shí)后均能正常轉(zhuǎn)色，而試驗(yàn)組(60μg/頭)中有3個(gè)卵圈(dsSoxE60-18、dsSoxE60-21和dsSoxE60-23)未能正常轉(zhuǎn)色，且不孵化，形成不受精卵。解剖對(duì)應(yīng)親本雄蛾并觀察