細胞思考題2015粗制版

1、定量檢測幾十萬個分散的細胞的定量檢測幾十萬個分散的細胞的DNADNA含量含量應(yīng)用流式細胞檢測技術(shù)（FCM）1.收集單細胞懸液(1106個)，緩慢加入1ml預(yù)冷的70％乙醇，于4℃固定過夜，或20℃長期固定。2離心收集細胞，再以1mlPBS徹底洗去乙醇；3去上清后加入染色液(包含50ugmlPI，100ugmlRNaseA，0.2%TritonX100)，37℃染色30min后上機檢測。4DNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒

2、光染料的結(jié)合量成正比，熒光強度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。通過流式檢測就能反映細胞內(nèi)DNA的含量?？淳€粒體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)以及此處的某種蛋白顆?？淳€粒體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)以及此處的某種蛋白顆?？淳€粒體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)及蛋白顆粒要用透射電鏡。定量檢測一批光鏡切片上含有某種蛋白質(zhì)的細胞的數(shù)目定量檢測一批光鏡切片上含有某種蛋白質(zhì)的細胞的數(shù)目首先對切片上的全部細胞進行針對目的蛋白的熒光探針特異性標記（熒光染色，熒光標記抗體，外源導入熒光蛋白），同時對細胞行核復

3、染。再以熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。熒光探針的特異性標記：即熒光強度與特異性標記蛋白的表達量成正相關(guān)了解細胞發(fā)生死亡時的形態(tài)學和某個酶的改變了解細胞發(fā)生死亡時的形態(tài)學和某個酶的改變首選以流式細胞術(shù)通過對檢測細胞以AnnexinVPI雙染法或亞二倍體(SubG1)峰的檢測分選出凋亡細胞。再熒光標記凋亡細胞的要檢查的酶，以激光掃描共聚焦顯微鏡觀察酶的變化。對細胞電子染色后以掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)。了解某個新基因所編碼的蛋白質(zhì)的功

4、能了解某個新基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能1.首選以Nthernblot檢測該蛋白在各組織中的表達。選出表達豐度最高組織細胞。2設(shè)立該組織細胞的cDNA文庫，從中篩選出與該蛋白有相互作用的蛋白（編碼基因）。3.以酵母雙雜交法及GSTpulldown方法對所篩選蛋白做驗證。4.由所篩選出的蛋白功能來分析推測該蛋白功能并用分子生化技術(shù)及細胞生化技術(shù)檢測。透射電子透射電子當樣品厚度小于100nm時，部分電子可穿透樣品，將穿透樣品的電子叫做透射電子，

5、利用透射電子信息成像的電子顯微鏡稱為透射電鏡。二次電子二次電子在入射電子的轟擊下，樣品表面5～50nm深度激發(fā)出來的電子稱為二次電子，利用二次電子信息成像的電子顯微鏡稱為掃描電鏡。電子顯微鏡：電子顯微鏡：電子顯微鏡鏡以電子射線作為照明源，以電磁場作為透鏡，具有高分辨率和放大倍率的顯微鏡。電鏡用于研究組織和細胞的超微結(jié)構(gòu)。分辨率分辨率表示人眼和光學儀器能夠辨別兩點之間最小距離的標志。免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)是將免疫學方法與電子

6、顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，利用抗原與抗體特異結(jié)合的特性，在超微結(jié)構(gòu)水平定位特異大分子的技術(shù)。負顯性突變：負顯性突變：對影響蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵位點進行突變，所得突變體不僅喪失了原有功能，并且可以抑制內(nèi)源性蛋白質(zhì)的功能。DNADNAmicroarraymicroarray：是一種用于分子生物學和醫(yī)學領(lǐng)域的高通量技術(shù).它由一系列成千上萬個精微的DNA寡核苷酸點排列而成，這些DNA寡核苷酸含有百億分之一摩爾特定序列的。它們或者是一小截基因，或者是DNA的

7、其他成分。它們被作為探針，在非常嚴格的條件下和一個叫做靶分子的cDNA或cRNA樣本雜交。由于靶分子帶有熒光標記，因此通過探針靶分子的雜交，并根據(jù)雜交后熒光的有或無，強或弱，對靶分子中特定核酸序列的豐度進行檢測。共激活因子共激活因子：是一種蛋白，本身不能與DNA結(jié)合，但能夠通過與具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的激活因子（或轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合來增強基因的表達。共激活因子可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的許多其他過程，如轉(zhuǎn)錄的延長、終止、RNA剪接以及激活因子和共激活因子復合

8、體的降解等。報告基因報告基因:是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控。sisiRNA(smallRNA(smallinterferinginterferingRNA)RNA)：也被稱為短干擾RNA(shtinterferingRNA)或沉默RNA

9、(silencingRNA)，通常為人工合成的長約20到25個核苷酸的雙股RNA，利用其可與特定信使RNA（mRNA）發(fā)生同源性結(jié)合并使之降解的特點，誘導序列特異的目標基因發(fā)生沉默，從而阻斷特定基因的表達。具有靶向、高效、易于操作的特點，是一種研究細胞內(nèi)基因表達的新技術(shù)。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIPCHIP）:研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復合物，并將其隨機切斷為

10、一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。凝膠遷移或電泳遷移率實驗（凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSAEMSA）:是一種研究核酸結(jié)合蛋白和其相關(guān)的核酸結(jié)合序列相互作用的技術(shù)。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結(jié)合的探針。DNA蛋白復