孕期低劑量BDE-209暴露對窒息新生鼠海馬的損傷影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　1.關(guān)于多溴聯(lián)苯醚（Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs）
　　多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs)是目前生產(chǎn)量和使用量最大的溴化阻燃劑，根據(jù)苯環(huán)上溴原子的個(gè)數(shù)和位置的不同，多溴聯(lián)苯醚總共有209種同分異構(gòu)體，被廣泛地應(yīng)用在塑料制品、電路板和建筑材料等領(lǐng)域，而且PBDEs在這些產(chǎn)品中的比重占到5％~30%。近年來，PBDEs在

2、環(huán)境中的濃度增長相當(dāng)快，大約每隔2-5年增加一倍，人體內(nèi)PBDEs的含量呈持續(xù)上升趨勢，據(jù)報(bào)導(dǎo)在PBDEs應(yīng)用于人類約25年的時(shí)間內(nèi)，PBDEs在血液中的水平已經(jīng)增長了100多倍。目前研究認(rèn)為，PBDEs主要通過食物鏈、呼吸及皮膚進(jìn)入機(jī)體后多數(shù)積累在脂肪組織，對機(jī)體健康產(chǎn)生不良影響，如：破壞甲狀腺激素，削弱學(xué)習(xí)和記憶能力，改變行為舉止，使聽覺神經(jīng)受損，積聚于靶器官如睪丸、卵巢等，減低精子數(shù)，導(dǎo)致胎兒畸形，甚至引發(fā)癌癥等。孕期的動物接觸了

3、 PBDEs，子代會出現(xiàn)體重減低、肝臟腫大、高膽固醇血癥，并嚴(yán)重?fù)p害胎兒健康，造成子代畸形、心臟腫大、肋骨彎曲、體重增加小等異常。有報(bào)道稱，PBDEs對母體里的胎兒或初生幼兒的傷害，比對成年者嚴(yán)重，而且所需劑量較小。因此,自2007年始，美國以及歐洲等地相繼限制低溴化合物如 BDE-47,99,153等的生產(chǎn)及使用。
　　2．關(guān)于BDE-209（Brominated Diphenyl Ethers-209,BDE-209）

4、　　BDE-209(Decabrominated diphenyl ether，BDE-209)是多溴聯(lián)苯（PBDEs）家族中使用最廣泛的一種同源物。研究發(fā)現(xiàn)低溴類具有與多氯聯(lián)苯( Polychlorinated biphenyl，PCBs)類似的生物毒性，故被禁用。而高溴類BDE-209的生態(tài)健康毒性目前仍不確定，由于熱穩(wěn)定性好，添加量少，價(jià)格便宜等優(yōu)勢，目前應(yīng)用最廣泛，占阻燃劑總量的75％。我國更是生產(chǎn)、使用 BDE-209最多的國

5、家。雖然有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo) BDE-209在人體的蓄積率較低溴聯(lián)苯醚弱，同時(shí) BDE-209存在光降解效應(yīng)，但因?yàn)槟壳碍h(huán)境中的 BDE-209濃度遠(yuǎn)大于其它形式的含溴阻燃劑，長期大量的暴露在體內(nèi)蓄積一樣可能引發(fā)嚴(yán)重的毒性作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)BDE-209與其他低溴類一樣具有生物毒性，包括神經(jīng)發(fā)育毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌毒性以及致癌性等，母體內(nèi) BDE-209也可通過胎盤屏障及乳汁傳遞至胎兒。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)大鼠妊娠期及哺乳期經(jīng)口暴露 BDE

6、-209后，仔鼠不僅學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，而且數(shù)目和體重也有明顯下降。在機(jī)制研究方面，BDE-209可影響甲狀腺激素的動態(tài)平衡以及神經(jīng)遞質(zhì)分泌，可造成仔鼠神經(jīng)突觸數(shù)目的減少及超微結(jié)構(gòu)的改變，引起神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、增加氧化應(yīng)激損傷、整體 DNA甲基化水平的升高，并可影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化。一般認(rèn)為目前地球生物暴露的濃度尚不足以導(dǎo)致明顯的生物毒性，但是隨著時(shí)間的推移，BDE-209的長期環(huán)境蓄積及生物放大作用必將會達(dá)到影響生物機(jī)能的臨界水

7、平，所以應(yīng)該盡量避免人類長期暴露于BDE-209。
　　3．關(guān)于孕期窒息( perinatal asphyxia）
　　神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常和功能缺陷是威脅兒童健康的重要因素之一，其在先天性發(fā)育異常中占有重要比例，約28.11%，每年因神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過2億元。孕期窒息容易導(dǎo)致新生兒缺氧缺血性腦損傷的發(fā)生，而新生兒窒息后缺氧缺血性腦損傷(hypoxia isehemia brain damage，縮寫HIBD

8、)是造成兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的首要原因，常導(dǎo)致新生兒遺留腦性癱瘓、癲癇、智力低下等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。孕期窒息是導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育異常的主要原因之一。Tan等發(fā)現(xiàn)胎羊?qū)m內(nèi)窒息后，胎羊腦組織出現(xiàn)充血、水腫及梗塞，并指出這種變化與在新生兒中觀察到的一致。Mallard等認(rèn)為窒息對神經(jīng)系統(tǒng)異常的模式與程度有很大的影響,且隨著胎齡的增加,神經(jīng)元對損傷的易感性增強(qiáng)。Ikeda發(fā)現(xiàn)大鼠單側(cè)窒息可導(dǎo)致選擇性和長期持續(xù)的學(xué)習(xí)記憶受損。常燕群等研究揭示窒息可損害

9、大鼠突觸傳遞效能的長時(shí)程增強(qiáng)(1ong-term potentiation，LTP)的誘導(dǎo)，這可能是腦缺氧缺血在突觸水平上影響學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)機(jī)制。Aydemir等發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激平衡失調(diào)更容易發(fā)生在孕期窒息新生兒身上，并和神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。目前通過研究宮內(nèi)窒息的動物模型，已經(jīng)證實(shí)實(shí)驗(yàn)動物大腦有典型凋亡現(xiàn)象提示宮內(nèi)窒息過程中有分子機(jī)制的存在，同時(shí)觀察到大腦的不同區(qū)域?qū)τ谥舷p傷的易感性不同。環(huán)境化學(xué)因素是近年導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育異

10、常的眾多因素中備受關(guān)注的另一重要因素。因?yàn)椋谏窠?jīng)發(fā)育的過程中，對環(huán)境化學(xué)因素的毒性作用特別敏感，可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育異常，而且日益增多的證據(jù)表明已受環(huán)境因素影響的胎兒更易受孕期窒息影響而產(chǎn)生神經(jīng)發(fā)育異常。
　　本課題主要從動物模型及體外試驗(yàn)兩方面進(jìn)行研究，在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，建立母源性BDE-209暴露后發(fā)生孕期窒息的動物模型，進(jìn)一步了解孕期低劑量BDE-209暴露對窒息新生鼠神經(jīng)發(fā)育異常的影響。通過光鏡觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)與

11、突觸發(fā)育情況，檢測海馬神經(jīng)元的細(xì)胞存活率，測定窒息新生鼠海馬組織丙二醛含量、超氧化物歧化酶活力及海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率，初步探討孕期低劑量BDE-209暴露對窒息新生鼠海馬組織的毒性影響及相關(guān)作用機(jī)制。本課題分為以下三個(gè)部分進(jìn)行各項(xiàng)具體實(shí)驗(yàn)。
　　第一部分、孕期低劑量BDE-209暴露對窒息新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響
　　【目的】
　　12周齡SD雌性大鼠建立孕期低劑量BDE-209暴露后發(fā)生窒息的動物模型，取新

12、生SD大鼠（24h內(nèi)）的海馬組織進(jìn)行原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)，鑒別神經(jīng)元的純度，觀察孕期低劑量BDE-209暴露對窒息新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。
　　【材料與方法】
　　1.購買12周齡SD雌性大鼠60只，雄性大鼠30只。將雌雄大鼠按2：1每3只合1籠，次日晨給雌鼠行陰道分泌物涂片檢查，倒置顯微鏡下見雄鼠精子滿視野為妊娠第0日,提出單獨(dú)飼養(yǎng)，未孕則繼續(xù)與雄鼠合籠，直到受孕。
　　2. SD雌性大鼠自妊娠0天起隨機(jī)分成

13、每組10只，A組:空白對照（單純花生油），B、C組：0.6、6 mg/kg BDE-209暴露組，D組:孕期窒息15分鐘，E、F組:0.6、6 mg/kg BDE-209暴露+孕期窒息15分鐘。B、C、E、F組雌鼠自妊娠第0天始，根據(jù)孕鼠體重按不同劑量將BDE-209溶解于2ml食用花生油中，每天下午避光胃灌1次，A、D組胃灌同量花生油以減少生理性差異，直至妊娠第21天（即孕22天）。
　　3.窒息模型的建立：A、B、C組孕鼠行剖

14、宮產(chǎn)術(shù)直接取出仔鼠，D、E、F組孕鼠行剖宮產(chǎn)將子宮血管完全夾閉15分鐘后，取出仔鼠，迅速促使仔鼠恢復(fù)自主呼吸，制成孕期窒息模型。每只孕鼠隨機(jī)抽取1只雄性仔鼠，每組共隨機(jī)抽取10只雄性仔鼠，在產(chǎn)后24小時(shí)內(nèi)取海馬組織進(jìn)行神經(jīng)元的原代培養(yǎng)。
　　4.培養(yǎng)7天后進(jìn)行海馬神經(jīng)元細(xì)胞純度鑒別。
　　5.在倒置顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　6. MTT比色法檢測神經(jīng)元細(xì)胞的存活率。
　　【結(jié)果】
　　1.

15、原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)第7天觀察神經(jīng)元胞體清晰明亮，呈明顯凸起狀，周圍暈光明顯，胞核及核仁清晰可見，突起變粗變長并有分支，邊緣清晰，形成明顯的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)法NeuN（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）鑒定神經(jīng)元的經(jīng)典方法。結(jié)果可見分散的海馬神經(jīng)元,神經(jīng)元是主體,可占95%。
　　3.倒置顯微鏡觀察不同實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，實(shí)驗(yàn)組可見神經(jīng)元細(xì)胞胞體變小，變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，隨著BDE-209濃度加大,可見神

16、經(jīng)細(xì)胞膜不完整，皺縮，空泡明顯，在劑量相同情況下，孕期窒息導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)損傷進(jìn)一步加劇，大量細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落，突起縮短甚至消失，空泡增多。
　　4. MTT比色法分析檢測神經(jīng)元的存活率，隨濃度增加細(xì)胞存活率有不同程度的下降，高濃度BDE-209可明顯降低海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率( P<0.05),孕期窒息能夠進(jìn)一步降低細(xì)胞存活率。
　　【結(jié)論】
　　孕期低劑量BDE-209暴露能夠損傷新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，使細(xì)

17、胞形態(tài)發(fā)生改變，其損傷程度與劑量呈一定的正相關(guān)。隨BDE-209濃度增加，細(xì)胞存活率有不同程度的下降，孕期窒息能夠進(jìn)一步損傷細(xì)胞形態(tài)，并降低細(xì)胞存活率，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷和存活率下降導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷可能是其神經(jīng)毒性作用機(jī)制之一。
　　第二部分、孕期低劑量BDE-209暴露對窒息新生鼠海馬丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響
　　【目的】
　　取12周齡SD雌性大鼠建立孕期低劑量BDE-209暴露后發(fā)

18、生窒息的動物模型，觀察新生鼠海馬組織丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響。
　　【材料與方法】
　　1.購買12周齡SD雌性大鼠60只，雄性大鼠30只。將雌雄大鼠按2：1每3只合1籠，給雌鼠行陰道分泌物涂片檢查，倒置顯微鏡下見雄鼠精子滿視野為妊娠第0天,提出單獨(dú)飼養(yǎng)，未孕則繼續(xù)與雄鼠合籠，直到受孕。
　　2. SD雌性大鼠自妊娠0天起隨機(jī)分成每組10只，A組:空白對照（單純花生油），B、C組：0.6

19、、6 mg/kg BDE-209暴露組，D組:孕期窒息15分鐘，E、F組:0.6、6 mg/kg BDE-209暴露+孕期窒息15分鐘。B、C、E、F組雌鼠自妊娠第0天始，根據(jù)孕鼠體重按不同劑量將BDE-209溶解于2ml食用花生油中，每天下午避光胃灌1次，A、D組胃灌同量花生油以減少生理性差異，直至妊娠第21天（即孕22天）。
　　3.窒息模型的建立：A、B、C組孕鼠行剖宮產(chǎn)術(shù)直接取出仔鼠，D、E、F組孕鼠行剖宮產(chǎn)將子宮血管完全

20、夾閉15分鐘后，取出仔鼠，迅速促使仔鼠恢復(fù)自主呼吸，制成孕期窒息模型。每只孕鼠隨機(jī)抽取1只雄性仔鼠，每組共隨機(jī)抽取10只雄性仔鼠，在產(chǎn)后24小時(shí)內(nèi)取海馬組織進(jìn)行進(jìn)一步檢測。
　　4.用酶標(biāo)儀采用硫代巴比妥酸法測定各組仔鼠海馬組織中丙二醛（MDA）含量。
　　5.用酶標(biāo)儀采用黃嘌呤氧化法測定各組仔鼠海馬組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性。
　　【結(jié)果】
　　1.各實(shí)驗(yàn)組仔鼠MDA含量隨BDE-209暴露劑量增加而增

21、高，在BDE-209劑量相同的情況下，孕期窒息能夠增加MDA含量，各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.14，P=0.000），析因分析結(jié)果表明BDE-209和孕期窒息之間無明顯的交互作用(F=1.02，P=0.368)。
　　2.各實(shí)驗(yàn)組仔鼠SOD活性隨BDE-209劑量增加而降低，在BDE-209劑量相同的情況下，孕期窒息能夠降低SOD活性。各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.227，P=0.000)。析因分析結(jié)

22、果表明BDE-209和孕期窒息之間存在明顯的交互作用(F=6.66，P=0.0026)。
　　【結(jié)論】
　　孕期低劑量的BDE-209暴露可抑制仔鼠海馬SOD活性，促進(jìn)MDA生成，出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，與劑量呈一定的正相關(guān)。孕期低劑量BDE-209暴露和窒息之間存在一定的交互作用，氧化應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷可能是其神經(jīng)毒性作用機(jī)制之一。
　　第三部分、孕期低劑量BDE-209暴露對窒息新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響
　

23、　【目的】
　　12周齡SD雌性大鼠建立孕期低劑量BDE-209暴露后發(fā)生窒息的動物模型，取新生SD大鼠（24h內(nèi)）的海馬組織進(jìn)行原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)，用流式細(xì)胞儀檢測孕期低劑量BDE-209暴露對新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。
　　【材料與方法】
　　1.購買12周齡SD雌性大鼠60只，雄性大鼠30只。將雌雄大鼠按2：1每3只合1籠，給雌鼠行陰道分泌物涂片檢查，倒置顯微鏡下見雄鼠精子滿視野為妊娠第0日,提出單獨(dú)飼養(yǎng)，

24、未孕則繼續(xù)與雄鼠合籠，直到受孕。
　　2. SD雌性大鼠自妊娠0天起隨機(jī)分成每組10只，A組:空白對照（單純花生油），B、C組：0.6、6 mg/kg BDE-209暴露組，D組:孕期窒息15分鐘，E、F組:0.6、6 mg/kg BDE-209暴露+孕期窒息15分鐘。B、C、E、F組雌鼠自妊娠第0天始，根據(jù)孕鼠體重按不同劑量將BDE-209溶解于2ml食用花生油中，每天下午避光胃灌1次，A、D組胃灌同量花生油以減少生理性差異，直

25、至妊娠第21天（即孕22天）。
　　3.窒息模型的建立：A、B、C組孕鼠行剖宮產(chǎn)術(shù)直接取出仔鼠，D、E、F組孕鼠行剖宮產(chǎn)將子宮血管完全夾閉15分鐘后，取出仔鼠，迅速促使仔鼠恢復(fù)自主呼吸，制成孕期窒息模型。每只孕鼠隨機(jī)抽取1只雄性仔鼠，每組共隨機(jī)抽取10只雄性仔鼠，在產(chǎn)后24小時(shí)內(nèi)取海馬組織進(jìn)行神經(jīng)元的原代培養(yǎng)。
　　4.采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，每組設(shè)6個(gè)平行樣品。
　　【結(jié)果】

26、>　　A組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率為4.15％，B組、C組、D組、E組和F組細(xì)胞凋亡率分別為：17.94%，30.65%，8.17%，25.95%，39.03%。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析各實(shí)驗(yàn)組仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率隨BDE-209暴露劑量增加而升高，在BDE-209劑量相同的情況下，孕期窒息能夠增加海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=337.85，P=0.000），析因分析結(jié)果表明BDE-209和孕期窒息之間有一定的交互作用(F=

27、10.95，P=0.002)。
　　【結(jié)論】
　　孕期低劑量的BDE-209暴露可誘導(dǎo)新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，其凋亡程度與劑量呈一定的正相關(guān)。在BDE-209劑量相同的情況下，孕期窒息能夠促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=337.85，P=0.000)。析因分析結(jié)果表明孕期低劑量BDE-209暴露和窒息之間存在一定的交互作用(F=10.95，P=0.002)。細(xì)胞凋亡導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷可能是其神經(jīng)