酶類藥物

1、酶類藥物,,酶類藥物,一.酶類藥物的概述二.酶類藥物的提取和純化三.重要酶類藥物的制備,酶是生物體內(nèi)具有生物催化活性的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸等。絕大多數(shù)酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與輔酶的復(fù)合體。 由于酶專一性強及催化效率高，使其在疾病的治療等方面具有針對性強，療效高等特點。,第一節(jié) 概述,一、藥用酶類的概述,（一）酶的特性酶是由活細胞產(chǎn)生的具有特殊催化 功能的一類蛋白質(zhì)。其特點：①催化效率高②專一性強③反應(yīng)條件溫

2、和④催化活性受到調(diào)節(jié)和控制,目前，從生物界已發(fā)現(xiàn)2000多種酶。其中：工業(yè)用酶約50～60余種； 治療和診斷用酶120多種； 試劑酶300多種； 基因工程工具酶100多種。,,一、藥用酶的分類及應(yīng)用（一）促進消化酶類（二）消炎酶類（三）與治療心腦血管疾病有關(guān)的酶類（四）抗腫瘤的酶類（五）與生物氧化還原電子傳遞有關(guān)的酶（六）其他

3、藥用酶,1、促進消化酶類,這類酶的作用是水解和消化食物中的成分，如蛋白質(zhì)、糖類和脂類等。最早使用的醫(yī)用酶，包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等水解酶。目前已從微生物制的不僅能在胃中、同時也能在腸中促進消化的復(fù)合消化劑，內(nèi)含蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶等。,2、消炎酶類,蛋白酶的消炎作用已為實驗所證實，從而促進了蛋白酶作為消炎劑的開發(fā)。如臨床上采用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠蘿半袋沒等治療炎癥和浮腫疾患，清除壞死組織等。消炎酶一

4、般做成腸溶性片劑。,3、溶血纖維蛋白酶類,這類酶的作用是防止血小板凝集、阻止血纖維蛋白形成或促進其溶解。已應(yīng)用于臨床的主要有鏈激酶、尿激酶、纖溶酶、凝血酶等。,4、抗腫瘤酶,能治療某些腫瘤，如L-天冬酰胺酶可用于治療白血病。谷氨酰胺酶、精氨酸酶、絲氨酸脫水酶、苯丙氨酸氨解酶和亮氨酸脫氫酶等也具有抗腫瘤活性。,5、其他藥用酶,如青霉素酶能分解青霉素，可應(yīng)用于治療青霉素引起的過敏反應(yīng)超氧化物歧化酶可消除超養(yǎng)負離子、防止脂質(zhì)過氧化，在抗

5、衰老、抗輻射、消炎等方面有顯著療效葡聚糖酶和右旋糖酐酶能預(yù)防齲齒等,一.酶類藥物的原料來源,(一) 原料選擇 選料應(yīng)注意一下幾點: (1) 不同酶的原料選擇 (2) 注意不同生長發(fā)育情況及營養(yǎng)狀況 (3)從原料來源是否豐富考慮 (4)從簡化提純步驟著手 (5) 如用動物組織做材料,則此動物宰殺后應(yīng) 立即取材,一.酶類藥物的原料來源,(二) 微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育 優(yōu)良菌種的獲得有三條途徑:

6、 1.從自然界分離篩選; 2.用物理或化學(xué)方法處理,誘變; 3.用基因重組與細胞融合技術(shù);,一.酶類藥物的原料來源,(三) 微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) 首先要合理選擇培養(yǎng)方法,培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度,PH和通氣量等,在工業(yè)生產(chǎn)中還要摸索一系列工程和工藝條件,如培養(yǎng)基的滅菌方式,種子培養(yǎng)條件等.還要研究酶的分離提純技術(shù)和制備工藝,這些條件的綜合結(jié)果將決定酶生產(chǎn)本身的經(jīng)濟效益.,返回目錄,二.酶類藥物的提取和純化,(

7、一) 生物材料的預(yù)處理 1.動物材料的預(yù)處理 (1) 機械處理 用絞肉機將事先切成的組織絞碎. (2) 反復(fù)凍融 凍到-10度左右,在緩慢溶解至室溫,如此反 復(fù)多次. (3) 丙酮粉 組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉,可在低溫下保存 幾年.,二.酶類藥物的提取和純化,2.微生物的預(yù)處理 要是酶是胞外酶,則可除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附取酶.但對胞內(nèi)酶

8、則需破壁,制成無細胞的懸液后再行提取. 通常用離心或壓濾的方法取得菌體,用生理鹽水洗滌后除去培養(yǎng)基后,應(yīng)深凍保存,有時為了大量保存或有利于提取,可采用干燥法.因為干燥法能導(dǎo)致細胞自溶,增加酶的釋放,從而在后處理中破壁不必太劇烈就能到達預(yù)期目的.,二.酶類藥物的提取和純化,(1) 干燥法 ① 空氣干燥 特別適合于酵母,當其中由于噴霧干燥法的溫度較高,對熱穩(wěn)定性差的酶不適用. ② 真空干燥 此法對細菌特別適用.對敏感性的酶,應(yīng)加

9、入少量還原劑保護酶. ③ 冷凍干燥 對較敏感的酶宜用此法.,二.酶類藥物的提取和純化,(2) 機械法 常用的方法有研磨法,組織勻漿法,超聲波法,高速勻漿法等.(3) 酶法處理 用的最多的是溶菌酶,也可用脫氧核糖核酸酶處理,二.酶類藥物的提取和純化,(二) 酶的提取 提取方法主要有水溶液法,有機溶劑法和表面活性劑法 1.水溶液法 常用稀鹽溶液或緩沖液提取.為了防止提取過程中酶活力降低,一般在低溫下操作,但

10、對耐高溫的酶,應(yīng)提高溫度,是雜蛋白變性,以利于酶的提取純化.,二.酶類藥物的提取和純化,PH的選擇對提取也很重要,應(yīng)考慮:1.酶的穩(wěn)定性; 2. 酶的溶解度; 3. 酶與其他物質(zhì)結(jié)合的性質(zhì). 選PH的總原則是:在酶穩(wěn)定的ph范圍內(nèi),選擇偏高等電點的適當ph. 一般來說,堿性蛋白酶用酸性溶液提取,酸性蛋白酶用堿性溶液提取;提取時加少量鹽可提高酶的溶解度.,二.酶類藥物的提取和純化,2.有機溶劑法 某些結(jié)合酶如微粒體和線

11、粒體膜的酶,由于和脂質(zhì)牢固結(jié)合,用水溶液很難提取,為此必須除去結(jié)合的脂質(zhì),且不能使酶變性,最常用的有機溶劑是丁醇.丁醇具有親脂性和親水性,在脂與水分子間起類似去垢劑的橋梁作用.,二.酶類藥物的提取和純化,3.表面活性劑 表面活性劑有親水性或疏水性的原子基團.有陽離子型,陰離子型和非離子型的.表面活性劑能與蛋白質(zhì)結(jié)合而分散在溶液中,故可用于提取結(jié)合酶,但此法用得較少.,二.酶類藥物的提取和純化,4.酶分離和純化工作中的注意事項(

12、1) 防止酶蛋白變性(2) 防止輔因子的流失(3) 防止酶被蛋白水解酶降解,返回目錄,三.重要酶類藥物的制備,(一) 藥用酶類的概述(二) 重要酶類藥物 1.胃蛋白酶 2.胰蛋白酶 3.尿激酶 4.溶菌酶

13、 5.L-天門冬酰胺酶 6.超氧化物歧化酶（SOD） 7.細胞色素C 8.彈性蛋白酶 9.激肽釋放酶,1.胃蛋白酶,廣泛存在于哺乳類動物的胃液中，藥用胃蛋白酶系從豬、牛、羊等家畜的胃液粘膜中提取。pI1.0，最適pH1.5～2.0，最適溫度37-40 ℃。,藥用胃蛋白酶是胃液中多

14、種蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、組織蛋白酶、膠原酶等，為粗制的酶制劑。外觀為淡黃色粉末，有肉類特殊氣味及微酸味。,返回目錄,1.胃蛋白酶,胃蛋白酶能水解大多數(shù)天然蛋白質(zhì)底物，尤其對兩個相鄰芳香族氨基酸（苯丙、酪、色）構(gòu)成的肽鍵最為敏感。對蛋白質(zhì)水解不徹底，產(chǎn)物有胨、肽和氨基酸的混合物。臨床上主要用于因食蛋白性食物過多所致消化不良及病后恢復(fù)期消化機能減退等。與堿性藥物配伍會降低效果。,1.胃蛋白酶－生產(chǎn)工藝,工藝路線,1.胃蛋白酶－

15、結(jié)晶胃蛋白酶的制備,藥用胃蛋白酶原粉， 20%酒精溶解。調(diào)pH3.0。5℃靜置20h后過濾，硫酸鎂鹽析。鹽析物在乙醇中溶解,過濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8～2.0，即析出針狀蛋白酶。制劑：含糖胃蛋白酶。系胃蛋白酶用乳糖、葡萄糖或蔗糖稀釋制得。,2.胰蛋白酶,從牛、羊、豬胰臟提取、結(jié)晶的凍干制劑，易溶于水，pI10.1。在酸溶液中穩(wěn)定，在堿溶液中加熱則變性沉淀。Ca2+有保護和激活作用。,牛胰蛋白酶原有229個氨基酸組成，含6對二硫鍵

16、，在腸激酶或自身催化下，釋放出6肽，變成有活性的胰蛋白酶。,返回目錄,2.胰蛋白酶－胰蛋白酶原激活示意圖,2.胰蛋白酶,牛胰蛋白酶分子量24000，由223個氨基酸殘基組成。胰蛋白酶專一作用于由堿性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所組成的肽鍵。胰蛋白酶屬絲氨酸蛋白水解酶。酶本身很容易自溶，降解為擬胰蛋白酶，乃至碎片，活力逐漸下降或喪失。胰蛋白酶臨床用于抗菌消炎，還用于治療毒蛇咬傷。也是一個重要的工具酶。,2.胰蛋白酶－生產(chǎn)工藝,3.尿激酶,

17、是一種堿性蛋白酶，由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人及哺乳動物的尿中。有多種分子量形式，主要有31300、54700兩種（低分子尿激酶（L-UK）、高分子尿激酶（H-UK）。,H-UK溶解血栓能力高于L-UK。尿激酶的pI為pH8-9,主要部分在pH8.6左右。,返回目錄,3.尿激酶,尿激酶具有溶解血栓的作用，已廣泛應(yīng)用于治療各種血栓形成或血栓梗塞等疾病。尿激酶激活纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白溶酶，纖溶酶具有較強的蛋白水解酶的能力，而纖維蛋

18、白原在凝血酶作用下，轉(zhuǎn)變成纖維蛋白凝塊，此凝塊在纖維蛋白酶作用下，水解為可溶性小分子多肽。,3.尿激酶－工藝路線：,,3.尿激酶－討論：,1. 采集的原尿要加防腐劑，惡臭尿不能用，尿液必須在10 ℃以下盡快處理，防止產(chǎn)生熱原和破壞酶。血尿和女性尿常含有紅細胞等成分，影響收率和質(zhì)量，故不能用。2.H-UK的溶解血栓的效果比L-UK的約高1倍，生產(chǎn)過程中pH就不宜太低，防止酶的降解。在低蛋白濃度、低離子強度、無穩(wěn)定劑及環(huán)境溫度較高時，均易

19、引起酶的失活。3.防止UK成品中含有熱原，主要措施是在制備的全過程特別是在精制中，需半無菌和無菌操作，提高成品的合格率。,3.尿激酶－討論：,4.尿中含有的鹽的濃度及其雜蛋白，會影響UK的吸附，尿中的某些蛋白酶能水解UK，這是提取過程中失活的重要原因之一。 5.除使用硅藻土吸附外，還有以纖維素、離子交換劑、分子篩等為吸附劑，另外還有利用親和層析法分離純化UK，其收率很高。 6.可利用右旋糖酐、聚乙烯二醇來穩(wěn)定UK。延長其半衰期

20、，提高穩(wěn)定性。,3.尿激酶－討論：,7.從尿液中提取UK，由于尿液存在肝炎病毒、艾滋病毒等污染的可能，因而制備中要考慮滅毒，而美國已禁止用尿液為原料生產(chǎn)藥物制劑。美國目前采用的是用人胎兒腎細胞培養(yǎng)，即組織培養(yǎng)法。在空間衛(wèi)星上分離出專門產(chǎn)生UK的細胞并進行UK的結(jié)晶工作，含量比一般提高100倍。,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）,溶菌酶全稱為1，4-β-N-溶菌酶，又稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?。溶菌酶是由129個氨基酸組成的單一

21、肽鏈，它是一種小分子堿性蛋白，它在機體中起非特異防御機制，是一種有效的抗菌劑。,返回目錄,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）,溶菌酶可通過水解細菌細胞壁的肽聚糖來溶菌，它能切斷肽聚糖中β-1，4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，在內(nèi)部滲透壓的作用下細胞脹裂開，引起細菌裂解。有些革蘭氏陰性菌，如埃希氏大腸桿菌，也會受到溶菌酶的破壞。人和動物細胞無細胞壁結(jié)構(gòu)也都沒有肽聚糖，故溶菌酶對人體細胞無毒性作用。,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）,

22、溶菌酶存在于自然界大多數(shù)動物、植物和微生物中。人們主要從雞蛋清中提取此酶。溶菌酶溶于水，不溶于丙酮、乙醚，無臭、味甜。pI為10.5-11.0，分子量14 000-15 000。酶的結(jié)晶形狀隨結(jié)晶條件而異。雞蛋清溶菌酶非常穩(wěn)定，耐熱、耐干燥、室溫下可長期穩(wěn)定。,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）－生產(chǎn)工藝2,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）－應(yīng)用,1.在食品中的應(yīng)用溶菌酶在人乳中含量相當高。溶菌酶是嬰兒生長發(fā)育必需的抗菌蛋白。所

23、以溶菌酶是嬰兒食品、嬰兒配方奶粉、飲料等良好的添加劑。溶菌酶添加牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的營養(yǎng)價值。因為卵清溶菌酶是無毒的蛋白質(zhì)，能選擇性地使目標微生物細胞壁溶解，人們利用它來代替有害健康的化學(xué)防腐劑如苯甲酸，以達到保存食物的目的。 可用于肉制品、糕點、海產(chǎn)品、飲料等的保鮮、防腐,利用溶菌酶保鮮楊梅的實驗左：溶菌酶組；右：對照組。,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）－應(yīng)用,2 .在醫(yī)藥臨床中的應(yīng)用溶菌酶是一種具有

24、殺菌作用的天然抗感染物質(zhì)，有抗菌、抗病毒、止血、消腫、鎮(zhèn)痛、加快組織修復(fù)等功能，還有增強免疫力、激活血小板的功能，且對人體無任何毒副作用，具有良好的醫(yī)療效果和廣闊的應(yīng)用前景。臨床上，溶菌酶適用于五官科各種炎癥，亦用于治療扁平疣、傳染性軟疣、尋常性疣、尖銳濕疣等多種皮膚病。此外,可用溶菌酶來制眼藥水、潤喉液等,因此溶菌酶是一種較為理想的藥用酶。另外，臨床上還把人體溶菌酶的濃度作為多種疾病的診斷標準。,4.溶菌酶（EC3.2.1.17）

25、－應(yīng)用,3 .在生物工程中的應(yīng)用溶菌酶是生物工程中必不可少的工具酶。一般應(yīng)用溶菌酶進行菌體或細胞破壁提取細胞內(nèi)容物（如原生質(zhì)體等）應(yīng)用于融合育種，或生產(chǎn)蛋白質(zhì)、核酸類呈味物質(zhì)。 在環(huán)境工程中也用溶菌酶處理污水、污泥。,5. L-天門冬酰胺酶,L-天門冬酰胺酶是從大腸桿菌菌體中提取分離的酶類藥物，白色粉末，微有濕性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚和甲醇。 最適pH8.5，最適溫度37 ℃。,返回目錄,5. L-天門冬

26、酰胺酶,最早是從1953年從豚鼠血清中發(fā)現(xiàn)的，為酰胺基水解酶，專一地催化天冬酰胺水解形成L-天門冬氨酸和氨，腫瘤細胞本身不能合成天冬酰胺，需依賴宿主供給，外源性天冬酰胺酶能使血液中天冬酰胺分解成天冬氨酸，從而使腫瘤細胞缺乏天冬酰胺而不能合成蛋白質(zhì)，從而達到抗腫瘤目的，主要用于治療白血病。,5. L-天門冬酰胺酶－生產(chǎn)工藝,5. L-天門冬酰胺酶－工藝過程,①菌種培養(yǎng)： 大腸桿菌A.S.1.375，普通牛肉培養(yǎng)基，接種后于

27、37℃培養(yǎng)24h。②種子培養(yǎng)： 16%玉米漿，接種量1%～1.5%，37℃，通氣攪拌培養(yǎng)4～8h。③發(fā)酵： 玉米漿培養(yǎng)基，接種量8%，37℃通氣攪拌培養(yǎng)6～8h。,5. L-天門冬酰胺酶－工藝過程,④菌體干粉制備： 離心分離發(fā)酵液，得菌體，加2倍量丙酮攪拌，壓濾, 濾餅過濾，自然風干成菌體干粉。⑤提取、沉淀、熱處理： 每千克菌體干粉加0.01mol/L的pH8的硼酸緩沖液10L

28、，37℃保溫攪拌1.5h，降溫到30℃以后，用5mol/l HAc調(diào)節(jié)pH4.2～4.4，進行壓濾，濾液中加入2倍體積的丙酮，放置3～4h。過濾、收集沉淀、自然風干，即得干粗酶。⑥精制、凍干,6.超氧化物歧化酶（SOD）,是一種重要的氧自由基清除劑，催化超氧陰離子自由基歧化為H2O2和O2：機體內(nèi)存在一套解毒系統(tǒng)，從而保護機體免受損傷,返回目錄,6.超氧化物歧化酶（SOD）,SOD屬金屬酶，按金屬離子種類不同：分為Cu、

29、Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。Cu、Zu型存在真核細胞。Fe型存在于原核細胞。Mn型存在于真核和原核細胞中。除了動物、微生物有SOD ，植物也有SOD。哺乳動物中的SOD主要分布在肝、肺、腎、紅血球等器官和組織。 SOD在體內(nèi)血中半衰期為6～9min,6.超氧化物歧化酶（SOD）－結(jié)構(gòu),對Cu、Zu-SOD研究的比較多，Cu和Zn與必需基團His(組)形成咪唑橋。Cu與4個His及1個H2O配位，Zu與3個His和1個A

30、sp（門冬）配位，構(gòu)成活性中心。,6.超氧化物歧化酶（SOD）－結(jié)構(gòu),6.超氧化物歧化酶（SOD）,實驗表明， Cu與Zn的作用是不同的， Zn僅與酶分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，而與催化活性無關(guān)，而Cu與催化活性有關(guān)，透析去除Cu則酶活性全部喪失。Cu、Zn-SOD分子量為32000，由153個氨基酸組成，由二個亞基組成。對pH, 熱比較穩(wěn)定。人的Cu、Zn-SOD的遺傳基因在第21條染色體上。,6.超氧化物歧化酶（SOD）－生產(chǎn)工藝,,6.超氧化