人鼠嵌合型基因工程抗體Hm2E8的研究.pdf

1、材料與方法： 1、真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8的構(gòu)建： 1.1 VH2E8、VL2E8基因的克隆與測序：以本研究室前期研究得到的帶有2E8重、輕鏈可變區(qū)序列(VH2E8、VL2E8)的pSectag2A/ScFv2E8質(zhì)粒作為模板， 1.2真核分泌型pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8重組桿狀病毒穿梭載體的構(gòu)建：將測序核實過序列正確的TA-VH2E8和pAc-κ-

2、CH3經(jīng)Xho Ⅰ和Nhe Ⅰ雙酶切處理后通過連接、轉(zhuǎn)化、篩選、擴增、抽提質(zhì)粒、酶切鑒定等步驟后，測序核實序列正確插入， 2、重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8轉(zhuǎn)染Sf9細胞、擴毒、表達重組抗體： 2.1 Sf9細胞、2E8細胞、Nalm-6細胞、High Five細胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)：按照常規(guī)方法進行，并進行Sf9和High Five細胞的無血清馴化。 2.2重組桿狀病毒穿梭載體pAc-

3、κ-CH3-VH2E8-VL2E8轉(zhuǎn)染Sf9細胞： 2.3重組完整病毒pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV感染Sf9細胞，擴毒： 2.4人鼠嵌合型CD19基因工程抗體在Sf9細胞中表達：以MOI(Multiplicity of Infection，MOI=病毒顆粒數(shù)/感染細胞數(shù))約為3-10，無血清培養(yǎng)條件下表達嵌合抗體。 3、重組蛋白的鑒定： 3.1細胞免疫熒光法、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS

4、-PAGE)、Western blot初步鑒定重組抗體在感染的Sf9細胞的表達。 3.2流式細胞術(shù)檢測重組抗體活性： 3.2.1流式細胞術(shù)以間標法檢測pAC-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染的Sf9細胞表達上清中的重組抗體活性：取無血清培養(yǎng)的Sf9細胞的表達上清和未感染Sf9細胞培養(yǎng)上清各60ml， 3.2.2流式細胞術(shù)檢測pAC-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染Sf9細胞的表

5、達上清對親本直標單抗2E8的阻滯作用：取Sf9細胞的表達上清和未感染Sf9細胞培養(yǎng)上清各60ml，超濾濃縮至400μl后，以100μl/次，阻滯Naml-6細胞兩次。 3.2.3流式細胞術(shù)間標法檢測pAC-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染的Sf9細胞裂解液中重組蛋白活性：取感染的Sf9細胞和未感染Sf9細胞制作裂解液， 4、改進裂解液配方，增加重組抗體可溶性及抗體的純化： 4.1用水配合超聲裂解

6、細胞：取pAC-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染的Sf9細胞，以2×107個細胞加1ml滅菌雙蒸水，加相應(yīng)的酶抑制劑；超聲功率240W開2秒停2秒，共20次， 4.2配制復(fù)性裂解液，加入氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽，去除去垢劑成分，配合超聲裂解細胞： 4.3復(fù)性裂解液裂解感染的Sf9細胞后，裂解液過ProteinA柱純化。 5、以High Five細胞表達重組抗體： 5.1以MOI約為

7、5-10，High Five細胞無血清培養(yǎng)條件下表達嵌合抗體。感染3天收集上清。 5.2上清濃縮后以流式細胞術(shù)間標法和阻滯法檢測抗體活性。方法同3.2。 結(jié)果： 1、真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8的構(gòu)建： 1.1 VH2E8，VL2E8基因的擴增、連接入pGEM(R)-T Easy載體(TA克隆)并測序鑒定：PCR產(chǎn)物電泳可見VH2E8泳道380bp左右條帶，VL

8、2E8泳道330bp左右條帶， 1.2真核分泌型pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8重組桿狀病毒穿梭載體的構(gòu)建：pAc-κ-CH3和TA-VH2E8雙酶切電泳可見目的條帶，切膠回收，連接后酶切鑒定， 2、真核分泌型重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8轉(zhuǎn)染Sf9細胞、擴毒、表達重組抗體： 2.1雜交瘤細胞復(fù)蘇后培養(yǎng)狀態(tài)良好，收集培養(yǎng)上清，得到親本鼠抗人CD19單抗2E8上清，4℃冰箱

9、保存?zhèn)溆谩f9和Nalm-6細胞狀態(tài)良好備用。 2.2重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8轉(zhuǎn)染Sf9細胞：轉(zhuǎn)染后觀察到細胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，有少量細胞碎片，細胞停止增殖等感染征象： 2.3擴增完整的重組病毒pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV：經(jīng)過三代擴增，100μl P0感染2×106個Sf9細胞擴增第一代重組桿狀病毒(P1)，50μl P1感染2×106個Sf9細胞擴增第二

10、代重組桿狀病毒(P2)，20μl P2感染2×106個Sf9細胞擴增第二代重組桿狀病毒(P3)。 2.4 pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染Sf9細胞2天，細胞感染征象即很明顯，6天時存活細胞約30％(圖4)， 3、重組蛋白的鑒定： 3.1.1細胞免疫熒光法鑒定轉(zhuǎn)染Sf9細胞內(nèi)的重組蛋白：Sf9細胞有綠色自發(fā)熒光，無紅色白發(fā)熒光，故選擇發(fā)紅色熒光的羅丹明標記的羊抗鼠Fab段作為二抗，

11、 3.1.2 SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達：以含血清或無血清培養(yǎng)的Sf9細胞感染pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3，表達上清濃縮10倍跑SDS-PAGE，未見與美羅華重、輕鏈位置相對應(yīng)條帶。 3.1.3 Western blot鑒定重組蛋白表達：經(jīng)辣根過氧化物酶標記的抗β-actin抗體(Anti-β-actin-HRP)標記顯影證實細胞裂解液制備成功； 3.2流式細胞術(shù)檢測重組蛋白活性。

12、 3.2.1流式細胞術(shù)間標法檢測pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8CV P3感染的Sf9細胞表達上清中重組抗體：pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染的Sf9細胞表達上清以間標法未檢測到抗體活性。 3.2.2流式細胞術(shù)檢測pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染Sf9細胞的表達上清對親本直標單抗2E8-FITC的阻滯作用： 3.2.3流式細胞術(shù)間標法檢測pAc-κ-CH3-

13、VH2E8-VL2E8 CV P3感染的Sf9細胞裂解液中重組蛋白活性：GAM-Fab-FITC組加感染的Sf9細胞裂解液后陽性細胞為14.35％(VS 2.97％)； 4、改進裂解液配方，增加嵌合抗體可溶性及抗體的純化 4.1以水和超聲裂解pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染的Sf9細胞。 4.1.1以水和超聲裂解感染的Sf9細胞，裂解上清和沉淀與傳統(tǒng)裂解液跑SDS-PAGE：可見在水裂解

14、的細胞裂解液中蛋白條帶更淡，但均有與美羅華重、輕鏈對應(yīng)的條帶。 4.1.2以水和超聲裂解感染的Sf9細胞，裂解液Western blot顯影：可見重組抗體僅有重鏈條帶，沒有輕鏈條帶，而陽性對照有重、輕鏈條帶。 4.2配制復(fù)性裂解液，配合超聲裂解pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染的Sf9細胞 4.2.1以復(fù)性裂解液，配合超聲裂解感染的細胞后，過Protein A柱純化嵌合抗體：洗脫時僅在pH

15、6.0洗脫液過柱時看到有一個小洗脫峰， 4.2.2收集洗脫液、過柱液，濃縮后與裂解液一起Western blot鑒定：可見洗脫液泳道無條帶，裂解液和過柱液泳道有淡條帶。 5、以High Five細胞表達重組抗體 5.1擴大培養(yǎng)High Five細胞并無血清馴化，表達重組抗體。 5.2流式細胞術(shù)檢測重組蛋白活性。 5.2.1流式細胞術(shù)間標法檢測pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感

16、染的High Five細胞表達上清中重組抗體：pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染的High Five細胞表達上清以間標法未檢測到抗體活性。 5.2.2流式細胞術(shù)檢測pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染High Five細胞的表達上清對親本直標單抗2E8-FITC的阻滯作用：pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV P3感染的High Five細胞表達上清中未能檢測到具有阻滯效

17、果的同表位抗體活性。 結(jié)論： 1、本研究成功地構(gòu)建了抗人CD19人鼠嵌合型基因工程抗體的重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8。 2、重組桿狀病毒穿梭載體pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8轉(zhuǎn)染Sf9細胞得到有感染性的完整重組桿狀病毒株pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV。 3、成功地擴增pAc-κ-CH3-VH2E8-VL2E8 CV至第三代，得到高滴度的病毒儲