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文檔簡介
1、人甲狀腺過氧化物酶(humanThyroidPeroxidase,簡稱hTPO)是人體甲狀腺激素合成過程中的關(guān)鍵酶,同時也是自身免疫性甲狀腺疾病(AutoimmuneThyroidDisease,簡稱AITD)患者體內(nèi)的一種主要自身抗原活性物質(zhì)之一,對其抗體的檢測對自身免疫性甲狀腺疾病,尤其是橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto'sThyroiditis,簡稱HT)的診斷有重要意義。 目的:利用分子生物學(xué)方法在原核系統(tǒng)表達(dá)hTPO
2、抗原決定簇片段,以基因工程產(chǎn)品為抗原,建立hTPO抗體檢測的ELISA定性及定量方法,并用于臨床作為AITD的診斷和療效監(jiān)測手段。 方法:將本室構(gòu)建的hTPO抗原決定簇“熱點”區(qū)基因(1702-2622,編號相對于起始密碼,編碼AA568-874)的重組表達(dá)質(zhì)粒pGESJ轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.ColiBL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)純化獲得GST-hTPO融合蛋白,并對其進(jìn)行分子量和免疫活性鑒定。以GST-hTPO為抗原,以ELISA方法
3、檢測臨床甲狀腺疾病患者血清內(nèi)hTPO抗體水平。 結(jié)果:1.GST-TPO融合蛋白的表達(dá)及純化以E.ColiBL21為表達(dá)菌株,以IPTG(isopropylβ-D-thoiglactoside,異丙基β-D-硫代半乳糖苷)為誘導(dǎo)劑,濃度1mM,25℃誘導(dǎo)5.5小時,產(chǎn)物經(jīng)GlutathioneSepharose4B親和層析純化后,使用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳)測定GST-hTPO分子量結(jié)果為61.24KD,經(jīng)
4、考馬斯亮藍(lán)染色法定量獲得融合蛋白表達(dá)產(chǎn)率為5mg/L培養(yǎng)基,ELISA結(jié)果證明GST-hTPO具有良好免疫活性,且GST與甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin,簡稱Tg)無交叉反應(yīng)。 2.以融合蛋白GST-hTPO為抗原建立定性及定量ELISA方法檢測患者血清中的TPO-Ab 反應(yīng)條件的優(yōu)化:按交叉連續(xù)稀釋法組合包被抗原量,人血清稀釋倍數(shù),二抗稀釋倍數(shù),結(jié)果在不同條件組合中當(dāng)包被抗原量為1μg/孔,人血清稀釋倍數(shù)為1
5、:1,二抗稀釋倍數(shù)為1;20000時,37℃顯色45分鐘時陽性血清與陰性血清的OD值差距最大(陽性血清值為陰性血清值二倍以上),故選作最佳條件。方法的重復(fù)性:樣品批內(nèi)變異系數(shù)為5.51%和6.75%,批間變異系數(shù)為8.95和9.51%。 3.臨床應(yīng)用以O(shè)D值大于1.127為陽性標(biāo)準(zhǔn),用此方法測定病人血清hTPO抗體,GD初診患者陽性率為10.4%(26/249例),橋本氏甲狀腺炎患者陽性率為79%(26/33例),亞急性甲狀腺炎
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