hTPO抗原決定簇熱點區(qū)基因原核表達及臨床應用.pdf

1、人甲狀腺過氧化物酶(humanThyroidPeroxidase，簡稱hTPO)是人體甲狀腺激素合成過程中的關鍵酶，同時也是自身免疫性甲狀腺疾病(AutoimmuneThyroidDisease，簡稱AITD)患者體內的一種主要自身抗原活性物質之一，對其抗體的檢測對自身免疫性甲狀腺疾病，尤其是橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto'sThyroiditis，簡稱HT)的診斷有重要意義。 目的：利用分子生物學方法在原核系統(tǒng)表達hTPO

2、抗原決定簇片段，以基因工程產(chǎn)品為抗原，建立hTPO抗體檢測的ELISA定性及定量方法，并用于臨床作為AITD的診斷和療效監(jiān)測手段。 方法：將本室構建的hTPO抗原決定簇“熱點”區(qū)基因(1702-2622，編號相對于起始密碼，編碼AA568-874)的重組表達質粒pGESJ轉化入表達菌株E.ColiBL21中進行誘導表達，經(jīng)純化獲得GST-hTPO融合蛋白，并對其進行分子量和免疫活性鑒定。以GST-hTPO為抗原，以ELISA方法

3、檢測臨床甲狀腺疾病患者血清內hTPO抗體水平。 結果：1.GST-TPO融合蛋白的表達及純化以E.ColiBL21為表達菌株，以IPTG(isopropylβ-D-thoiglactoside,異丙基β-D-硫代半乳糖苷)為誘導劑，濃度1mM，25℃誘導5.5小時，產(chǎn)物經(jīng)GlutathioneSepharose4B親和層析純化后，使用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳)測定GST-hTPO分子量結果為61.24KD，經(jīng)

4、考馬斯亮藍染色法定量獲得融合蛋白表達產(chǎn)率為5mg/L培養(yǎng)基，ELISA結果證明GST-hTPO具有良好免疫活性，且GST與甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin,簡稱Tg)無交叉反應。 2.以融合蛋白GST-hTPO為抗原建立定性及定量ELISA方法檢測患者血清中的TPO-Ab 反應條件的優(yōu)化：按交叉連續(xù)稀釋法組合包被抗原量，人血清稀釋倍數(shù)，二抗稀釋倍數(shù)，結果在不同條件組合中當包被抗原量為1μg/孔，人血清稀釋倍數(shù)為1

5、：1，二抗稀釋倍數(shù)為1；20000時，37℃顯色45分鐘時陽性血清與陰性血清的OD值差距最大(陽性血清值為陰性血清值二倍以上)，故選作最佳條件。方法的重復性：樣品批內變異系數(shù)為5.51％和6.75％，批間變異系數(shù)為8.95和9.51％。 3.臨床應用以OD值大于1.127為陽性標準，用此方法測定病人血清hTPO抗體，GD初診患者陽性率為10.4％(26/249例)，橋本氏甲狀腺炎患者陽性率為79％(26/33例)，亞急性甲狀腺炎