人造血增效因子hhsf在e.coli中的表達(dá)、純化及其快速動員恒河猴外周血造血干祖細(xì)胞作用的研究

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文人造血增效因子（hHSF）在E.coli中的表達(dá)、純化及其快速動員恒河猴外周血造血干/祖細(xì)胞作用的研究姓名：齊春梅申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：楊克恭;陳松森20030701中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文A B S T R A C TH u n l a n h e m a t o p o i e t i c s y n e r g i s t i cf a c t o r ( h H S

2、 F ) i S a N - t e r m i n a l 4 一a at r u n c a t e d f o r i l lo fG R O 1 3 ，am e m b e r o f C X C c h e m o k i n e s ．I t c o n s i s t so f 6 9 a a , s e l e c t i v e l y b i n d s t or e c e p t o rC X C R 2 ．a(chǎn)

3、n d c a l lb e p r o d u c e d b y b o n e m a r r o w s t r o m a l c e l l si nr e s p o n s e t os t i m u l a t i o n b vS K & F 1 0 7 6 4 7 ．a(chǎn) h e m a t o r e g u l a t o r y p e p t i d e ．I t sm a i n b i o l

4、o g i c a la c t i v i t y h a s b e e ns h o w n t oi n d u c en e u t r o ，p h i lc h e m o t a x i s ，s t i m u l a t e n e u t r o p h i la c t i v a t i o n ，a n de n h a n c e a n t i —i n f e c t i v ea c t i v i

5、t y i nh o s t ．R e c e n t l y , h H S F w a s d e m o n s t r a t e d t oh a v e p o t e n t h e m a t o p o i e t i c e n h a n c i n ga c t i v i t i e s ．h H S Fr a p i d l ya n dt r a n s i e n t l ym o b i l i z e

6、 sa b r o a ds p e c t r u mo f h e m a t o p o l e t i cp r o g e n i t o rc e l l s ，l o n g - t e r mr e p o p u l a t i n gc e l l s ，a n dn e u t r o p h i lc e l l si n t ot h ep e r i p h e r a lb l o o da f t e r

7、as i n g l es u b c u t a n e o u si n j e c t i o ni nm i c e a n d M a c a c a m a l a t t a m o n k e y s ．a(chǎn) n d i ts y n e r g i z e s 謝t l lG —C S F ’T h e s er e s u l t sp r o v i d ea r a t i o n a l ef o r t h e

8、p o t e n t i a lc l i n i c a lu t i l i t yo f h H S F a l o n e o ri nc o m b i n a t i o nw i t hG —C S Ft om o b i l i z eh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l sf o ru s e i np e r i p h e r a lb l o o ds t e mc e

9、 l lt r a n s p l a n t a t i o n ．I nt h i ss t u d y , t h eh H S F g e n ew a s s y n t h e s i z e da n dh i g h l ye x p r e s s e di n E ．c o l ib y g e n e e n g i n e e r i n g m e t h o d ．R e c o m b i n a n t

10、h H S F ( r h H S F ) w a s p u r i f i e d ，i d e n t i f i e d ，a n d i t sb i o l o g i c a l a c t i v i t yw a s a s s a y e d ．T h e r e a r e f o u r p a r t si n t h i s p a p e r ：1 ．C o n s t r u c t i o no f e

11、 x p r e s s i o np l a s m i d p E T 3 0 a —h H S Fa n d h i g he x p r e s s i o no f h H S Fi n E C O 玨A n a r t i f i c i a lD N A f r a g m e n te n c o d i n g h H S F W a ss y n t h e s i z e d b y u s i n g p r e

12、 f e r a b l ec o d o n si nE c o l f ．1 1 1 e s e q u e n c e o f h H S F g e D ew a s c o r r e c t a ss h o w n b y g e n e s e q u e n c i n g ．T h e n t h eh H S Fg e n eW a sc l o n e di n t ot h ee x p r e s s i o

13、 np l a s m i dv e c t o rp E T 3 0 a ，a n dt h er e c o m b i n a n tv e c t o r sw e r e t r a n s f e r r e di n t oE c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) ．I n d u c e d b v I P T G ．t h ee x p r e s s i n gl e v e lo ft h er e

14、c o m b i n a n tp r o t e i nr e a c h e da b o v e3 0 ％o f t h et o t a lb a c t e r i ap r o t e i n ．m o s to fw h i c hw e r ei n t h e i n c l u s i o nb o d y ．T h r e ed i f i e r e n tc u l t u r et e m p e r a

15、t u r e ( 3 7 “ C ．3 4 ℃a n d2 9 ℃r e s p e c t i v e l y ) W a se x p e r i m e n t e d ．T h er a t eo f s o l u b l eh H S F i n c r e a s e dw i t ht h ed e c r e a s eo ft e m p e r a t u r e ．H o w e v e r , t h e r

16、 a t eo f h H S F i ni n c l u s i o n b o d y W a s s t i l lp r e d o m i n a n t ．2 ．P u r i f i c a t i o na n d r e n a t u r a t i o no f r h H S RT h ep r o c e d u r eo fr h H S F p u r i f i c a t i o nw a s a s

17、f o l l o w s ：d i s s o l u t i o no f i n c l u s i o nb o d vi nd e n a t u r a n t S e p h a c r y l S 一1 0 0 r e n a t u r a t i o n —d i a l y z a t i o n S P ．S e p h a r o s e —d i a l y z a t i o na g a i s tP B

18、 S ．P a r t o f t h e r l l H S F W a s f i l r t h e rp u r i f i e db yR P 一腫L C ．1 ％h u m a n a l b u m i nw a sa d d e d t ot h er e s to f i t ，t h e nf i l t e r e dt h r o u 曲0 ．2 2p r n f i l t r a t i o nm e m b

19、 r a n e s ．w ef o u n dt h a ts o l u t i o ni n c l u d i n g4m 0 1 ／1 g u a n i d i n eh y d r o c h l o r i d ea n d2 m e l ／Lu r e aw a ss u i t a b l e f o rd i s s o l v i n gr h H S Fi n e l u s i o nb o d y ．T h

20、 eo p t i m i z e dm n a t u r i n gc o n d i t i o nW a sa s f o l l o w s ：ar e n a t u r a t i o ns o l u t i o ni n c l u d i n g1 e s st h a l l 1 0 0p g ／m lr h H S F ，0 ．4m o l ／La r g i n i n e ，1 m o l ／Lg u a n

21、 i d i n eh y d r o c h l o r i d e a n d0 ．5 m m o l ／L ／o ．5i n m o l 幾G S H ／G S S GW a sp r e f e r r e d ．a(chǎn) n dr e n a t u r i n gf o r4 8h o U r Sa t4 ℃W a S s e l e c t e d ．A tl a s t ．t h ep u f f t yo f r h H S