Notch通路在小鼠胚胎干細(xì)胞分化為造血干-祖細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、[目的]
　　通過使用Jagged-1組蛋白活化Notch信號(hào)通路及DAPT(γ-分泌酶抑制劑)抑制Notch信號(hào)通路，研究不同條件下該通路對小鼠胚胎干細(xì)胞分化為造血干/祖細(xì)胞中的影響，進(jìn)而探討Notch信號(hào)通路在小鼠胚胎干細(xì)胞分化中的作用。
　　[方法]
　　1.原代體外培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，作為胚體干細(xì)胞的飼養(yǎng)層
　　無菌超凈臺(tái)內(nèi)取出孕12.5d胚胎，去除頭尾、四肢及內(nèi)臟，將軀干組織剪碎，消化法獲

2、得細(xì)胞懸液，鋪皿后體外培養(yǎng)，隔天換液，2-3d消化法傳代培養(yǎng)。
　　取第二到第四代細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C處理作為飼養(yǎng)層。
　　2.小鼠胚胎干細(xì)胞體外增殖
　　復(fù)蘇購買的小鼠胚胎干細(xì)胞在經(jīng)絲裂霉素C處理好的飼養(yǎng)層上，加含LIF的ESCs培養(yǎng)基，每天或隔天換液，3-4d消化傳代培養(yǎng)。
　　3.小鼠胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化
　　3.1擬胚體形成
　　將誘導(dǎo)生長的擬胚體經(jīng)胰酶-EDTA消化后，吹打制成單細(xì)胞懸液，差時(shí)

3、貼壁法分離去除飼養(yǎng)層細(xì)胞，在無飼養(yǎng)層無LIF條件下培養(yǎng)4d，可形成球形擬胚體。
　　3.2按計(jì)劃分5組加藥處理培養(yǎng)10天。
　　①EB組，②Control組，③Jagged-1組，④DAPT組，⑤Jagged-1-DAPT組。
　　其中EB組即為擬胚體細(xì)胞凍存10天后復(fù)蘇組;Control組為無飼養(yǎng)層無LIF培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)擬胚體細(xì)胞，處于自然分化狀態(tài);其余各組為加入活化劑或（和）抑制劑并在無飼養(yǎng)層無LIF條件下培養(yǎng)的

4、擬胚體細(xì)胞(Jagged-1100ng/ml，DAPT10nmol/ml)，加藥后培養(yǎng)10天，屬于調(diào)控分化狀態(tài)。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠造血干/祖細(xì)胞
　　收集誘導(dǎo)分化培養(yǎng)10d的細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠胚胎干細(xì)胞特異性表型CD31，SSEA1及造血干/祖細(xì)胞特異性表型CD117，CD34，Sca1。
　　5.RT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)
　　抽提上述誘導(dǎo)10d各組細(xì)胞的總RNA，RT-PCR法檢測Notch

5、信號(hào)通路基因Notch1，Notch2，Notch4，Hes1;小鼠胚胎干細(xì)胞表型基因SSEA1，Oct4;及造血干/祖細(xì)胞表型基因Sca1，H2k，c-kit。
　　6.Western-Blot檢測Nocth1蛋白表達(dá)
　　提取上述誘導(dǎo)10d的各組細(xì)胞的總蛋白，采用Western-Blot檢測Nocth1的表達(dá)量。
　　[結(jié)果]
　　1.加入Jagged-1組蛋白和（或）DAPT改變了Notch信號(hào)通路基因及蛋

6、白的表達(dá)量。
　　1.1 Notch信號(hào)通路相關(guān)基因Notch1，Notch2，Notch4 mRNA表達(dá)量變化
　　Jagged-1組Notch1，Notch2，Notch4 mRNA表達(dá)量較Control組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DAPT組及Jagged-1-DAPT組之Notch1、Notch4 mRNA表達(dá)量較Control組降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示Jagged-1組

7、蛋白激活了Notch信號(hào)通路，DAPT抑制Notch信號(hào)通路。
　　1.2 Notch通路下游靶基因Hes-1上調(diào)
　　Jagged-1組Hes1表達(dá)較Control組及DAPT組、Jagged-1-DAPT組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;但Control組比DAPT組、Jagged-1-DAPT組表達(dá)量增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;
　　1.3 Western Blot檢測Notch1蛋白表達(dá)

8、量
　　Jagged-1組與Control組相比Notch1蛋白表達(dá)量明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但DAPT組、Jagged-1-DAPT組與Control組之間的表達(dá)差異不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)合PCR基因檢測結(jié)果推斷，Jagged-1組蛋白激活了Notch信號(hào)通路，DAPT抑制Notch信號(hào)通路，但分化后的細(xì)胞Notch通路作用能力減弱，與DAPT的作用結(jié)果相類似。
　　2.使用D

9、APT增強(qiáng)了胚胎干細(xì)胞向造血干/祖細(xì)胞的分化效應(yīng)，而使用 Jagged-1組蛋白削弱了胚胎干細(xì)胞向造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的分化效應(yīng)。
　　2.1流式細(xì)胞術(shù)鑒定胚胎干細(xì)胞及造血干/祖細(xì)胞
　　(1) DAPT組及Jagged-1-DAPT組分化的造血干/祖細(xì)胞數(shù)較EB組、Control組及Jagged-1組明顯增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而DAPT組與Jagged-1-DAPT組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

10、，提示阻斷該通路能ESCs向造血干/祖細(xì)胞分化;
　　(2) Jagged-1組細(xì)胞胚胎干細(xì)胞數(shù)較Control組、DAPT組及Jagged-1-DAPT組明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而較EB組的干細(xì)胞稍減少，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DAPT組與Jagged-1-DAPT組之間小鼠胚胎干細(xì)胞數(shù)相比較無明顯差異，提示激活Notch信號(hào)通路能抑制干細(xì)胞的分化。
　　2.2 RT-PCR檢測相關(guān)基因

11、
　　(1)檢測干細(xì)胞相關(guān)表型基因SSEA1，Oct4，c-Kit，H-2k和Sca1表達(dá)量變化如下:
　?、倥cESCs組相比，除Jagged-1組SSEA1及Oct4mRNA表達(dá)量外無明顯降低，其余各實(shí)驗(yàn)組的SSEA1（P＜0.01）及Oct4(P＜0.05)mRNA表達(dá)量明顯降低，提示存在ESCs分化，而Jagged-1組蛋白通過激活Notch通路抑制ESCs的分化;
　?、跈z測造血干/祖細(xì)胞基因特異性基因c-Ki

12、t, H-2k，各實(shí)驗(yàn)組均可測出，表明各實(shí)驗(yàn)組均存在已分化的造血干/祖細(xì)胞。DAPT組及Jagged-1-DAPT組表達(dá)量較其余各組明顯增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而Sca1表達(dá)量較Control組稍低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); Jagged-1組較EB組表達(dá)量差異不明顯，不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明DAPT促進(jìn)小鼠造血干/祖細(xì)胞表型基因c-Kit，H-2k，Sca1的表達(dá)，而Jagged-1組蛋

13、白抑制基因的表達(dá)，進(jìn)而推斷Notch通路抑制胚胎干細(xì)胞分化向造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞分化。
　　(2) Notch信號(hào)通路相關(guān)基因Notch1，Notch2，Notch4表達(dá)量變化下:
　?、倥cESCs組細(xì)胞相比，Jagged-1-DAPT組、DAPT組及Control組的Notch1，2，4的mRNA的表達(dá)量均有降低，考慮為胚胎干細(xì)胞分化后Notch1，2，4基因可能受到抑制;DAPT組及Jagged-1-DAPT組之Notch

14、1、Notch4表達(dá)量較Control組降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明添加通路阻斷劑DAPT促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化;
　?、诙鳭agged-1組雖Notch1，Notch2，Notch43個(gè)受體表達(dá)量均有下降，但與ESCs組相比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示激活Notch通路能抑制胚胎干細(xì)胞分化，進(jìn)而推斷Notch通路抑制胚胎干細(xì)胞分化。
　　2.3 Western Blot檢測Notch1蛋白表

15、達(dá)量
　　免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測到除Jagged-1組外，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)量均較胚胎干細(xì)胞明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Jagged-1組與胚胎干細(xì)胞相比雖有所下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);說明分化后Notch通路中Notch1蛋白表達(dá)量降低，同時(shí)Jagged-1組蛋白激活Notch通路，維持Notch1蛋白較高表達(dá)量，進(jìn)而推斷激活Notch通路能抑制干細(xì)胞的分化。
　　[結(jié)論]