日本血吸蟲pcdna3.1()mlp質(zhì)粒的構(gòu)建及其對家兔免疫作用的初步研究

1、南華大學碩士學位論文日本血吸蟲pcDNA3.1(+)/MLP質(zhì)粒的構(gòu)建及其對家兔免疫作用的初步研究姓名：劉彥申請學位級別：碩士專業(yè)：病原生物學指導教師：肖建華20030501劉彥 南畢大學2 0 0 3 屆同等學力人員碩士學位論文日本血吸蟲p c O N A 3 ．1 ( + ) I M L P 質(zhì)粒的構(gòu)建及其對家兔免疫作用的初步研究T h e c o n s t r u c t i o n o f r e c o m b i n a

2、n t p l a s m l d s 酊p c D I 妣& 1 ㈣P 時艘場蚰嘴眥．b 州凼齜l d Ⅱt 蹭馳a l d I a f 蛔塒伽蚵細e 垂塒協(xié)m e m h b i m中文摘要目的：分離編碼日本血吸蟲中國大陸株粘蛋白樣器自( m u c i n ～l i k ep r t ) t e i n ，M L P )的基因，進行基因序列測定及序列分析；克隧于卜載體，亞克隆于真核表達載體；構(gòu)建牯蛋自樣蛋白札P 核酸疫茁，

3、并觀察萁對動物模型的保護性免疫效果，為核酸疫苗在舡吸蟲病預防研究中提供候選抗原及實驗依據(jù)。方法：用計算機軟件P C G E - N E 分析曼氏血吸蟲枯蛋白樣蛋白| f L P 基因序列，根據(jù)分析結(jié)果，選取乳p 中可能含有抗原表位的基因片斷，用P G G E I , J E 軟件，根據(jù)其基因保守序列，自行撥計引物，用聚合酶鏈式反應( P C R ) 的方法擴增日本血吸蟲中國大陸株M L P 基因2 5 3 —1 0 0 9 h p 間片

4、段，克隆入載體p u C a - T 。將p u C m - - l g L P 中的M L P 外源基因片段籀酶切、連接等反應，亞克隆入p c D N A 3 ．1 ( 十) 真核表達載體，再經(jīng)含氨帶墉培養(yǎng)基篩選，酶切、電泳、P C R 鑒定。將得到的血吸蟲中國大陸株M L P 基因進行D N A 序列測定，并與其它蟲株中相應序列進行同源性比較。用肌肉注射方法將構(gòu)建的p c D N A 3 ．1 ( + ) 噸L P 、p c D N

5、 A 3 ．1 ( + )窯質(zhì)粒、生理鹽水分3 組免疫新西蘭家兔，間隔2 周免疫一次，l ，個月后，用P C R 方法、環(huán)卵沉淀法及免疫組化法對h ' L P 基因在家兔體內(nèi)的穩(wěn)定存在、表迭及免疫學活性進行初步研究。用血吸蟲尾蚴攻擊感染免疫家兔，研究桉酸疫苗誘導保護性免疫的效果。結(jié)果：在曼氏血吸蟲札P 全長序列中含有蘭個親水性甄基酸高峰區(qū)域，是可能的T細胞、B 細胞抗原褻位；l I T —P C R 方法獲得了日本虹吸蟲中國大陸

6、株札P 的2 5 3 一j 0 0 9 b D間約7 5 6 h D 基因片段；構(gòu)建的D a D N A 3 ．1 ( + ) u 4 { L P 測序鑒定含有日本血吸蟲中國大陸株M L P的部分結(jié)構(gòu)基因；將獲得的序列與曼氏血吸蟲的相應序列比較呈高度同源性，僅有7 拿核苷酸的差異，氨基酸序列有三個不同。用構(gòu)建的核酸疫苗免疫家兔，取家兔的肌肉組織用P C R 方法檢測M L p 序列，結(jié)果為陽性；免疫組化法檢測扎P 基因可在p c D N