日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗的構(gòu)建及其免疫應(yīng)答的動(dòng)態(tài)觀察.pdf

1、目的：采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗，利用分子免疫學(xué)技術(shù)研究該疫苗免疫BALB/c鼠誘導(dǎo)的動(dòng)態(tài)免疫應(yīng)答，以期為血吸蟲病的防治提供一種新型、安全、有效的疫苗。
　　方法：家兔感染Sj尾蚴42d后剖殺，經(jīng)門靜脈灌注法收集Sj成蟲，以用RNeasy Mini試劑盒抽提到的成蟲總RNA為模板，RT-PCR法擴(kuò)增Sj26GST抗原編碼基因;從本室保存的重組菌BL21中抽提載體質(zhì)粒(pGEX-1λT);利用T4

2、 DNA連接酶將抗原編碼基因與載體連接，得到重組質(zhì)粒pGEX-Sj26GST;將重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化Bb得到重組Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中，經(jīng)TPTG誘導(dǎo)后，利用SDS-PAGE和Western blot研究其表達(dá)效率。
　　將88只BALB/c鼠隨機(jī)分為兩組，每組44只，分別經(jīng)皮下注射（SC組）和鼻腔粘膜（IN組）接種重組疫苗免疫小鼠，在免疫后0～20周，每2周每組隨

3、機(jī)剖殺4只小鼠，取眼球血，用常規(guī)ELISA法檢測(cè)血清抗體IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgE，雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子;無(wú)菌取脾，制備懸浮脾細(xì)胞，用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)脾細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀(FACsort)檢測(cè)T細(xì)胞亞群和脾細(xì)胞凋亡、雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子（IFN-γ、 IL-10和IL-17）的動(dòng)態(tài)變化。
　　結(jié)果：RT-PCR擴(kuò)增出676bp

4、的Sj26GST抗原編碼基因;雙酶切證實(shí)Sj26GST抗原編碼基因成功插入pGEX-1λT載體中，在重組Bb疫苗中，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為676bp的目的基因片段;SDS-PAGE分析提示重組質(zhì)粒pGEX-Sj26GST經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)大小約52kDa的融合蛋白，薄層掃描分析示表達(dá)的融合蛋白約占總菌體蛋白的20％，且在誘導(dǎo)后3～5h表達(dá)量較高，Western blot表明該融合蛋白可被Sj感染

5、的兔血清識(shí)別。
　　SC組小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA水平分別于免疫后8、6、10、8、10和10周達(dá)最大值(P＜0.01或P＜0.05); IN組IgG、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA分別于免疫后6、10、4、12和6周達(dá)峰值(P＜0.01或P＜0.05)，IgG1在整個(gè)過(guò)程中升高不明顯，且于16～20周輕微下降;兩組均未檢測(cè)到IgE。SC組小鼠血清IFN-γ于4周升高明顯并達(dá)峰值

6、，IN組于10周達(dá)最大值(P＜0.01或P＜0.05); SC組IL-17于6～8周顯著升高并達(dá)峰值;IN組于4周達(dá)最大值(P＜0.05)，兩組均未檢測(cè)到IL-10。SC組小鼠脾細(xì)胞增值水平于免疫后8W達(dá)最高水平;IN組于免疫后4W達(dá)最大值(P＜0.01或P＜0.05)。SC組和IN組CD4+T細(xì)胞均于8W達(dá)峰值(P＜0.01或P＜0.05);兩組CD8+T細(xì)胞分別于8W和6W達(dá)較高值(P＞0.05)。SC組脾細(xì)胞凋亡水平于免疫后2W達(dá)

7、最大值（P＜0.01或P＜0.05）;IN組于4周達(dá)峰值(P＜0.01)。與0W比，SC組和IN組脾細(xì)胞上清液中IFN-γ水平均于免疫后2W達(dá)峰值(P＜0.01);SC組和IN組IL-17水平分別于14W和12W達(dá)較高水平(P＜0.01或P＜0.05);兩組均未檢測(cè)到IL-10。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗;重組質(zhì)粒pGEX-Sj26GST可在大腸埃希菌BL21中獲得表達(dá)，且表達(dá)的融合蛋