日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗構(gòu)建及其免疫應(yīng)答的動態(tài)研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬構(gòu)建日本血吸蟲rBb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗及其表達情況；研究rBb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗免疫BALB/c鼠后免疫應(yīng)答的動態(tài)變化，為日本血吸蟲病的防治提供一種新型安全有效的疫苗。
　　方法：
　　以Sj成蟲總RNA作為模版，RT-PCR擴增得到Sj14-3-3抗原編碼基因，將其定向克隆到pGEX-1λT表達載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3，采用電穿孔法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

2、到Bb中，構(gòu)建rBb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗；再利用電穿孔的方法將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達菌BL21(DE3)中，分別經(jīng)SDS-PAGE電泳分析及Westernblot鑒定IPTG誘導(dǎo)后其產(chǎn)物的表達情況。將rBb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗分別經(jīng)口服和鼻腔黏膜兩種免疫途徑接種BALB/c鼠，在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22w動態(tài)觀察其免疫反應(yīng)的變化，ELISA法測定小鼠血清中IgG及其亞類

3、、IgE和IgA及脾細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平，MTT比色法對脾臟淋巴細胞的增殖情況進行研究；FCM測定CD4+和CD8+T細胞亞群的百分率及脾細胞的凋亡率。
　　結(jié)果：
　　凝膠電泳證明成功擴增出399bp的Sj14-3-3目的基因；雙酶切驗證成功構(gòu)建質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3；PCR表明成功構(gòu)建rBb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗；SDS-PAGE證明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組質(zhì)

4、粒pGEX-Sj14-3-3在BL21(DE3)中可表達Sj14-3-3/GST融合蛋白，此蛋白Mr為40kDa，表達效率21％，且在誘導(dǎo)3～7h時表達的量達到最大值；蛋白印跡表明此蛋白可被感染Sj的兔血清識別。動態(tài)研究發(fā)現(xiàn)：與0w相比，口服組小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分別于免疫后8、6、6、4、8、10和6w達較高值，鼻腔黏膜組各抗體分別于免疫后4、6、4、4、8、10和8w達較高水

5、平；兩組脾淋巴細胞增殖及凋亡水平均于免疫后4w達最大值；口服組CD4+T細胞于免疫后8w達最高值，CD8+T細胞于免疫后14w達較高值，鼻腔黏膜組CD4+T細胞于免疫后8w達最高值，CD8+T細胞于免疫后4w達較高值；口服組脾細胞懸液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10分別于免疫后8、8、6和4w達最高水平，鼻腔黏膜組脾細胞懸液中各細胞因子分別于免疫后2、2、4和4w達最高水平?？诜辔讣氨乔火つそ臃N均是較好的免疫途徑，且鼻