溫度對(duì)巴氏醋桿菌發(fā)酵性能及胞內(nèi)代謝的影響.pdf

1、在工業(yè)醋酸發(fā)酵中，發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量熱，發(fā)酵溫度的提高會(huì)嚴(yán)重影響發(fā)酵速率和發(fā)酵效率。在液態(tài)發(fā)酵中，為了嚴(yán)格控制溫度，出現(xiàn)冷卻成本昂貴問(wèn)題，尤其是在夏季，許多醋酸工廠面臨停產(chǎn)難題。適當(dāng)提高醋酸發(fā)酵溫度，可以大大節(jié)約冷卻成本，實(shí)現(xiàn)全年生產(chǎn)，還可以避免雜菌污染。因此，進(jìn)行耐高溫醋酸菌的改良和選育對(duì)醋酸發(fā)酵具有十分現(xiàn)實(shí)的意義。本文嘗試通過(guò)基因工程和適應(yīng)性突變兩種方法獲得耐熱突變株，對(duì)獲得的耐熱突變株進(jìn)行發(fā)酵性能檢測(cè)和代謝組學(xué)研究，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)代謝圖譜

2、變化分析，獲得巴氏醋桿菌對(duì)溫度刺激的胞內(nèi)代謝響應(yīng)機(jī)制。
　　將巴氏醋桿菌中的熱休克蛋白基因grpE-dnaK-dnaJ克隆至表達(dá)載體pMV24，在大腸桿菌中成功表達(dá)，重組大腸桿菌在48℃下的耐受性得到提高。下一步嘗試在巴氏醋桿菌中表達(dá)。
　　通過(guò)熱激適應(yīng)實(shí)驗(yàn)獲得耐熱突變株，對(duì)其在40℃下的發(fā)酵性能進(jìn)行檢測(cè)。在40℃條件下，其醋酸產(chǎn)量達(dá)到15.96±1.02 g/L，比原始菌株醋酸產(chǎn)量提高了21.65％。在發(fā)酵初期ADH比活力

3、是原始菌株的ADH比活力的1.4倍，最佳初始乙醇濃度為3％，可以耐受1％的乙酸，最佳接種量為10％。
　　基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)分析了不同溫度下巴氏醋桿菌胞內(nèi)代謝物的變化。代謝組學(xué)分析中，對(duì)55種胞內(nèi)代謝物進(jìn)行了定性及相對(duì)定量分析，主成分分析、偏最小二乘判別分析發(fā)現(xiàn)草酸、乳酸、甘油、葡萄糖、葡萄糖酸、十六烷酸為生物標(biāo)志物。結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，兩株菌的葡萄糖代謝流主要流向葡萄糖酸方向，并且在40℃受到抑制。原始菌株的

4、TCA循環(huán)活性在40℃受到一定程度抑制，與24h時(shí)相比，檸檬酸和蘋果酸在60h時(shí)積累量分別提高了166.7％和242.8％。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，兩株菌的甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸和異亮氨酸都存在不同程度的積累。但是，耐熱突變株的天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸和異亮氨酸在40℃時(shí)含量減少。檢測(cè)到與細(xì)胞膜流動(dòng)性相關(guān)的四種不飽和脂肪酸和六種飽和脂肪酸，隨著溫度的上升，UFA/SFA比率隨之降低，表明溫度壓力改變了細(xì)胞膜的