利用纖維素產(chǎn)丁醇微生物的發(fā)酵工藝及基因工程改造.pdf

1、生物能源作為一種可再生能源，能夠有效地解決能源危機(jī)、環(huán)境污染和經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展等諸多問(wèn)題。丁醇包括正丁醇和異丁醇，因其較高的能量密度、在運(yùn)輸與儲(chǔ)存方式上的安全性與便利性、與乙醇相比的低吸濕性和低腐蝕性、與汽油相近的理化特性以及其作為化工原料的廣泛應(yīng)用前景，得到了世界各國(guó)的廣泛關(guān)注與重視?，F(xiàn)階段生物發(fā)酵丁醇生產(chǎn)中面臨的主要問(wèn)題是發(fā)酵生產(chǎn)成本居高不下，利用豐富的、廉價(jià)的可再生的纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)丁醇是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本研究針對(duì)目前制約纖維原料

2、生物轉(zhuǎn)化正/異丁醇研究中纖維素酶成本高，轉(zhuǎn)化效率低的主要技術(shù)瓶頸，考察了粗酶液水解秸稈發(fā)酵產(chǎn)正丁醇的效能以及利用微生物的協(xié)同作用構(gòu)建了纖維素直接生物轉(zhuǎn)化正丁醇的共培養(yǎng)體系，同時(shí)結(jié)合合成生物學(xué)的指導(dǎo)思想，構(gòu)建了纖維素直接生物轉(zhuǎn)化異丁醇的基因工程菌，并對(duì)其穩(wěn)定性及效能進(jìn)行了分析，論文取得主要研究成果如下：
　　針對(duì)纖維素糖化發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇過(guò)程中纖維素酶的高成本、低活性問(wèn)題，采用綠色木霉（Trichoderma viride）的胞外粗酶

3、液進(jìn)行纖維素基質(zhì)的酶解糖化。通過(guò)中心組合響應(yīng)面法優(yōu)化粗酶液水解纖維素條件，在pH5.1、水解溫度50.7℃、纖維素酶添加量41.1 U/g、底物濃度38.1 g/L條件下，粗酶水解液中還原糖含量為17.32 g/L，糖化率為62.42％，其糖化效率達(dá)到了商品酶R10的82.3%。利用丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicium）ATCC824對(duì)粗酶水解液進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇，研究表明在分步糖化發(fā)酵工藝中正丁醇產(chǎn)量，

4、產(chǎn)率和生產(chǎn)速率分別為7.05 g/L、0.155 g/g底物和0.141 g/L·h；在同步糖化發(fā)酵工藝中正丁醇終濃度為5.05 g/L，產(chǎn)率和生產(chǎn)速率分別為0.127 g/g底物與0.080 g/L·h。該結(jié)果證實(shí)低成本的纖維素酶粗酶液替代商品酶進(jìn)行高效纖維素水解糖化及正丁醇的發(fā)酵生產(chǎn)具有可行性，為纖維素基質(zhì)轉(zhuǎn)化正丁醇發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程的成本降低提供了一個(gè)新思路。
　　根據(jù)微生物間的協(xié)同效應(yīng)的原理，并結(jié)合現(xiàn)有共培養(yǎng)體系研究中各組分菌株

5、生長(zhǎng)及作用條件不匹配問(wèn)題，分別選用本實(shí)驗(yàn)室前期富集篩選得到的中溫厭氧纖維素降解菌系N3和速生梭菌（Clostridium celevecrescens）N3-2，建立了復(fù)合菌系N3和速生梭菌（C. celevecrescens）N3-2與產(chǎn)正丁醇菌株丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicium） ATCC824的共培養(yǎng)體系。在37℃中溫培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)體系N3+ ATCC824和N3-2+ ATCC824降解纖維素產(chǎn)正丁醇能力分別

6、為3.73 g/L和2.69 g/L，正丁醇產(chǎn)率分別為0.145 g/g底物和0.134 g/g底物。該研究結(jié)果為在中溫厭氧條件下實(shí)現(xiàn)纖維素直接生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)正丁醇提供重要的理論依據(jù)和參考價(jià)值。
　　針對(duì)目前尚未發(fā)現(xiàn)有原始菌株可以直接合成異丁醇以及現(xiàn)有異丁醇基因工程菌株無(wú)法利用纖維素基質(zhì)直接轉(zhuǎn)化異丁醇的研究現(xiàn)狀，構(gòu)建了一株能夠高效降解纖維素發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇的工程菌株。首先通過(guò)纖維素降解菌株的篩選，得到一株能夠高效降解纖維素的蠟樣芽孢桿

7、菌（Bacillus cereus）W12。異丁醇耐受性分析發(fā)現(xiàn)W12菌株較其他常見(jiàn)基因工程宿主菌株具有更高的異丁醇耐受能力。在此基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pMA5，將aro10與adh2兩個(gè)基因轉(zhuǎn)入W12菌株中得到工程菌株W12-RD，發(fā)酵試驗(yàn)檢測(cè)其異丁醇產(chǎn)量為0.126 g/L，初步實(shí)現(xiàn)了利用Ehrlich途徑合成異丁醇的能力。研究發(fā)現(xiàn)不同的基因連接順序會(huì)影響特定基因的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)而影響了異丁醇產(chǎn)量。通過(guò)在發(fā)酵體系中添

8、加不同的Ehrlich途徑前體物質(zhì)，W12-RD菌株能夠合成對(duì)應(yīng)的醇類(lèi)，驗(yàn)證了該方法的普適性，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Ehrlich途徑的合成具有競(jìng)爭(zhēng)性。
　　為了進(jìn)一步提高異丁醇的產(chǎn)量，我們對(duì)異丁醇合成前體2-酮異戊酸合成關(guān)鍵基因alsS進(jìn)行過(guò)表達(dá)，并敲除pta與pflB基因，以阻斷丙酮酸旁路消耗。得到工程菌株 W12-C2B，采用聯(lián)合生物加工工藝進(jìn)行纖維素基質(zhì)轉(zhuǎn)化異丁醇的一步法發(fā)酵生產(chǎn)，最終異丁醇產(chǎn)量為1.310 g/L、異丁醇產(chǎn)率及最高