siRNA靶向沉默Notch1基因?qū)細胞淋巴瘤細胞Notch1-c-Myc信號通路影響的研究.pdf

1、目的:
　　探討siRNA靶向沉默Notch1基因?qū)細胞淋巴瘤細胞的增殖及凋亡作用的影響，以及對T細胞淋巴瘤細胞Notch1/c-Myc信號通路的影響。
　　方法:
　　選取Jurkat細胞作為T細胞淋巴瘤模型，取對數(shù)生長期的細胞進行如下實驗研究。提取DNA進行Notch1基因的外顯子27、34進行測序，測定其突變位點，利用RNA干擾技術(shù)（RNAi）合成兩段小干擾RNA序列（siRNAⅠ和siRNAⅡ）靶向沉默Not

2、ch1基因。在進行細胞轉(zhuǎn)染72h之后，利用共聚焦顯微鏡觀看轉(zhuǎn)染的綠色熒光（慢病毒攜帶），然后用嘌呤霉素篩選成功轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定的細胞株（慢病毒載體攜帶抗嘌呤霉素基因）。用篩選好的轉(zhuǎn)染成功的Jurkat細胞進行該實驗研究。每項試驗至少重復(fù)三次。利用CCK-8法分析轉(zhuǎn)染后的Jurkat細胞的活力；分別提取Jurkat細胞總RNA和總蛋白，進行實時熒光定量PCR（RT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測Notch1及其靶基因c-

3、Myc和凋亡基因Caspase3 mRNA和蛋白相對表達水平；并利用流式細胞術(shù)檢測siRNA靶向沉默Notch1基因?qū)urkat細胞凋亡的影響。利用單因素方差分析對所有的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05則認(rèn)為具有明顯差異。
　　結(jié)果:
　　1.siRNA轉(zhuǎn)染組Ⅰ細胞增殖能力下降（0.472?0.202），與細胞對照組和siRNA陰性對照組相比，均具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.001)；siRNA轉(zhuǎn)染組Ⅱ增殖能

4、力下降（0.468?0.063），與細胞對照組和siRNA陰性對照組相比，均具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.001)；
　　2.siRNA轉(zhuǎn)染組Ⅰ細胞凋亡明顯增加（25.170?1.756），與細胞對照組和siRNA陰性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.000，P=0.000)，siRNA轉(zhuǎn)染組Ⅱ細胞凋亡增加（7.300?0.600），與細胞對照組和siRNA陰性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.002，P=0.002

5、)；siRNA轉(zhuǎn)染組Ⅰ和siRNA轉(zhuǎn)染組Ⅱ相比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.000）；
　　3.siRNA轉(zhuǎn)染組Ⅰ Notch1、c-Myc mRNA表達水平下降（0.090?0.000、0.267?0.012），與細胞對照組相比均具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.000），與siRNA陰性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.000），Caspase3 mRNA表達水平增加（2.490?0.713），與細胞

6、對照組和siRNA陰性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.004，P=0.005)；siRNA轉(zhuǎn)染組ⅡNotch1、c-Myc mRNA表達水平下降（0.233?0.006、0.327?0.045），與細胞對照組相比均具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.000），與siRNA陰性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.000），Caspase3 mRNA表達水平增加（2.217?0.204），與細胞對照組和siR

7、NA陰性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.011，P=0.014)；
　　4.siRNA轉(zhuǎn)染組ⅠNotch1、c-Myc蛋白表達水平下降（0.713?0.065、0.718?0.125），與細胞對照組相比均具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.014），與siRNA陰性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.020），Caspase3蛋白表達水平增加（1.245?0.033），與細胞對照組和siRNA陰性對

8、照組相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.001)；siRNA轉(zhuǎn)染組ⅡNotch1、c-Myc蛋白表達水平下降（0.897?0.175、0.871?0.125），與細胞對照組相比均具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.021），與siRNA陰性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.000，P=0.030），Caspase3蛋白表達水平增加（1.149?0.096），與細胞對照組和siRNA陰性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異