Notch1特異的RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖的影響.pdf

1、目的： 構(gòu)建針對Notch-1基因的RNAi慢病毒表達載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制Notch-1基因表達，為研究Notch-1信號通路提供技術(shù)工具；并利用構(gòu)建的RNAi慢病毒感染神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，觀察抑制Notch-1信號通路對神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y增殖的影響。 方法： 設(shè)計合成兩對針對Notch-1 mRNA不同位點的shRNA編碼序列，克隆到慢病毒穿梭質(zhì)粒中，然后通過Ga

2、teway重組構(gòu)建重組RNAi慢病毒表達載體；在293FT細胞中包裝并進行病毒滴度測定，獲得高滴度的病毒上清；慢病毒感染神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y，RT-PCR和Western Blot檢測構(gòu)建的RNAi慢病毒對Notch-1表達的抑制效果；利用RNAi慢病毒抑制Notch-1表達，探討Notch-1信號通路對神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y增殖的影響。 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建了針對Notch-1基因兩個不同位點的RNA

3、i慢病毒表達載體，經(jīng)PCR和測序鑒定干擾片段的堿基序列及插入位點完全正確； 2、在293FT細胞中包裝，獲得高滴度慢病毒上清；病毒液滴度在1.5×105TU-2.3×105TU之間，可滿足后續(xù)實驗需要； 3、構(gòu)建的兩個RNAi慢病毒感染SH-SY5Y細胞后可使Notch-1mRNA表達量分別下降80％和66％； 4、慢病毒感染SH-SY5Y后進行MTT檢測，RNAi慢病毒組與無義干擾組和對照組相比，細胞增殖率明顯