1，5-脫水山梨醇的測(cè)定及其應(yīng)用研究.pdf

1、背景與目的：近年來，越來越多的人為糖尿病所折磨，糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病之一，這引起了人們的極大關(guān)注。但是，遺憾的是，人類目前尚不能治愈這種疾病。因此，糖尿病作為一種慢性病，早預(yù)防，早診斷，早治療，對(duì)于糖尿病患者的預(yù)后來說尤其重要。為適應(yīng)這種要求，我們開展了糖尿病早期診斷試劑盒的研制與開發(fā)。而1,5-脫水-D-山梨醇是一種存在于人類血液中的正?；衔?，由于其代謝穩(wěn)定，在血液中波動(dòng)范圍小，可及時(shí)反應(yīng)血糖的短期變化，具有空腹血糖

2、、果糖胺和糖化血紅蛋白所不具有的特征，在糖尿病的診斷與治療中很有價(jià)值，值得臨床推廣和應(yīng)用。 方法：由于本試劑盒的前半部分已經(jīng)完成，本研究為糖尿病早期診斷試劑盒的研制與開發(fā)的后期實(shí)驗(yàn)部分，本試驗(yàn)擬計(jì)劃包括五部分來完成： 一、已糖激酶底物特異性實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用相同的己糖激酶偶聯(lián)6-磷酸葡萄糖脫氫酶試劑對(duì)3種濃度的12種糖進(jìn)行催化特異性實(shí)驗(yàn)； 二、葡萄糖脫氫酶底物特異性實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用相同的葡萄糖脫氫酶試劑和固定參數(shù)對(duì)12

3、種糖類物質(zhì)進(jìn)行催化率實(shí)驗(yàn)研究； 三、吡喃糖氧化酶底物特異性實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用相同的吡喃糖氧化酶試劑和固定參數(shù)對(duì)12種糖類物質(zhì)、甘油和乙二醇等進(jìn)行催化率實(shí)驗(yàn)研究； 四、葡萄糖清除實(shí)驗(yàn)研究，首先用已糖激酶將樣品中內(nèi)源性的葡萄糖轉(zhuǎn)化為毗喃糖氧化酶(PROD)無催化作用的6-磷酸葡萄糖，然后用葡萄糖氧化酶檢測(cè)樣品中葡萄糖的殘留情況； 五、1，5-脫水-D-山梨醇檢測(cè)方法的建立與臨床應(yīng)用，使用已經(jīng)建立的血清1，5-脫水-D-山

4、梨醇檢測(cè)方法對(duì)86例健康人、134例糖耐量異常病人和106例非胰島素依賴型糖尿病患者進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果： 一、將其對(duì)葡萄糖的催化作用定為100％時(shí)，已糖激酶/葡萄糖6磷酸脫氫酶試劑對(duì)山梨糖、甘露醇無催化活性；對(duì)山梨醇幾乎無催化活性(0.01％)；對(duì)果糖，(0.59％)和木糖(0.54％)有極弱的催化活性；對(duì)半乳糖和1，5-脫水-D-山梨醇的催化活性分別為1.80％和1.24％；對(duì)乳糖無催化活性，對(duì)蔗糖和纖維二糖幾乎無催化活

5、性，對(duì)麥芽糖則有平均2.55％的催化活性。 二、將其對(duì)葡萄糖的催化作用定為100％時(shí)，葡萄糖脫氫酶對(duì)單糖中的半乳糖催化率最高可以達(dá)到17.13％，其次是木糖，可以達(dá)到8.27％，對(duì)1.5-脫水-D-山梨醇的催化作用則很弱，僅為1.51％，對(duì)果糖、山梨糖、甘露醇、山梨醇則幾乎無催化作用；葡萄糖脫氫酶對(duì)雙糖中的乳糖的催化率可以達(dá)到17.93％，對(duì)纖維二糖和麥芽糖的催化作用很低，兩者分別為2.63％和1.80％，對(duì)蔗糖則幾乎沒有催化作

6、用，僅為0.39％。 三、將其對(duì)葡萄糖的催化作用定為100％時(shí)，吡喃糖氧化酶對(duì)單糖中的山梨糖催化率最高可以達(dá)到87.51％，其次是木糖(83.17％)和1，5-脫水-D-山梨醇(82.32％)，半乳糖為40.69％，對(duì)果糖、甘梨醇、山梨醇幾乎無催化作用；吡喃糖氧化酶對(duì)雙糖中的麥芽糖催化率為3.19％，對(duì)乳糖、蔗糖、纖維二糖幾乎無催化作用；對(duì)同等濃度的非糖類物質(zhì)甘油和乙二醇的催化作用也很小，但是對(duì)于高濃度的甘油和乙二醇(應(yīng)用濃度在

7、2.2～3.3％)催化活性則很高。 四、本方法可將樣品中高達(dá)60mmol/L，即10.8g/L的葡萄糖完全轉(zhuǎn)化。 五、1，5-脫水-D-山梨醇水平在86例正常人(106.1±59.9)和134例糖耐量異?；颊?49.4±40.1)及106例非胰島素依賴型糖尿病患者(9.6±11.6)之間差異具有顯著性意義(P<0.001)，糖尿病患者的血清1，5-脫水-D-山梨醇水平明顯降低。 結(jié)論： 一、在建立新的檢測(cè)

8、方法前要對(duì)酶的底物催化特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 二、應(yīng)用葡萄糖脫氫酶建立葡萄糖測(cè)定方法前應(yīng)做葡萄糖脫氫酶的糖底物特異性催化實(shí)驗(yàn)研究。 三、建立1，5-脫水-D-山梨醇測(cè)定方法前應(yīng)做吡喃糖氧化酶對(duì)不同糖底物、甘油和乙二醇的特異性催化實(shí)驗(yàn)研究。 四、由于吡喃糖氧化酶底物催化特異性不好，在測(cè)定1，5-脫水-D-山梨醇前，必須先清除樣品中的葡萄糖，以避免干擾樣本中1，5-脫水-D-山梨醇的測(cè)定。 五、1，5-脫水-D-山