hiv-1b亞型gp120基因密碼子優(yōu)化前后免疫原性的比較

1、第 2 0卷 第 3期 2004 年 9 月病 毒 學 報 CHl NES E J OURNAL 0F Vl ROLOGY VO 1 ． 2 0S c o t ．NO． 32004HI V ． 1 B亞型 g p l 2 0基 因密 碼 子優(yōu) 化 前 后 免疫 原 性 的 比較 余 雙慶 ， 馮 霞 ， 陳 國敏 ， 龔 非 ， 周玲 ， 曾毅 ( 中 國疾病預(yù)防控制 中心 病 毒病 預(yù)防控制所 ， 北京 1 0 0 0

2、5 2 )摘要 ： 對 HI V 一 1 B亞 型 g p l 2 0基因按照哺乳動物優(yōu)勢密碼子 的使 用原 則進行優(yōu)化 ， 以 We s t e r nb l o t 方法 比較 其體外 表達量。將 優(yōu)化前 的野 生型 g p l 2 0基 因和改 造后 的 mo d g p l 2 0基因 插入 重組 腺伴 隨病 毒載 體 ， 構(gòu)建 了重 組病 毒 r A AV - wt g p l 2 0和 r A A v— m o d g p

3、l 2 0 ， 比較兩者免疫 B a l b ／ C小 鼠后 的抗體 和 C T L應(yīng)答 。We st e r n b l o t 檢測 結(jié)果顯示 ：優(yōu)化后基 因的體外表達量 明顯高于野生 型基 因，A V — m o d g p l 2 0 與 r A A V - w t g p l 2 0 相 比可更好地誘導(dǎo) B a l b ／ C小 鼠的 C TL應(yīng)答 ， 但檢 測不到 明顯的抗 體反 應(yīng)。由此得 出結(jié)論 ， 優(yōu)化 后 g p

4、l 2 0基因 的體外表達量 明顯高 于野生 型基 因，并且可以誘 導(dǎo)更強 的特異性 C TL應(yīng)答 ， 但檢測 不到 g p l 2 0抗體 。關(guān)鍵詞 ： 人免疫缺陷病毒 I型 ( HI V- 1 ) ； 密碼 子優(yōu)化 ； 重組腺伴隨病毒 ； C TL應(yīng)答 中圖 分 類 號 ： R 3 7 3 ． 9 ； Q 7 8文 獻標 識 碼 ： A文章 編 號 ： 1 0 0 0 —8 7 2 1 l 2 0 0 4 ) 0 3 —0 2 1

5、4 —0 4人 免疫缺 陷病 毒 l 型 ( h u m a ni m mu n o d e f i c i e n c yv i r u st y p el ， HI V— 1 ) 在 中國 的流行 非常嚴 重 ， 自國內(nèi) 首 例艾 滋病 患 者 于 1 9 8 5年 6月發(fā) 現(xiàn) ， 截 止 2 0 0 2年 6 月 ， 共發(fā) 現(xiàn) H I V 感 染 者 1 0 0萬 例 。專 家 估 計 ， 若 不采取措 施進 行 預(yù) 防控 制 ，

6、 到 2 0 1 0 年 ， 中 國 的 HI V感染 者將達 到 10 0 0 萬 。研 制安 全 、 有效 、 廉 價 的艾 滋病疫 苗來 控制艾 滋病 的傳播 已非常 緊迫 。研 究表 明 ， 細胞 介導(dǎo) 的免 疫 應(yīng) 答 ， 尤 其 是 細胞 毒 性 T 淋 巴細胞 ( C T L ) 在 早 期 控 制 H I V — l的傳 播 中起 著 重 要 作用 【 1 ． 2 ] 。H I V 外膜 糖 蛋 白( E n v ) 是

7、 體 液免 疫 應(yīng) 答 的主要靶標 ， 可誘 導(dǎo)較 高水 平 的中和抗 體 ， 同 時含有 豐 富的 C T L表位 ， 但在 R e v 缺 陷 的系統(tǒng) 中表 達量很 低 ， 大大 降低 了其 免 疫 原 性 。本 文對 g p l 2 0基 因進 行 了密碼 子優(yōu)化 ， 使 其 在 R e v缺 陷 的 系統(tǒng) 中表 達量 得 到了 明顯提 高 ， 并 在 動 物 體 內(nèi)激 發(fā) 了較 強 的 細胞 免 疫應(yīng)答 。材 料 與 方 法 1

8、 菌株 及質(zhì)粒 大腸 桿菌 DH 5 a為本 室保存 ， 質(zhì)粒 p S N A V 由本元正 陽基因有限公 司提供 。2 病毒 與細胞 Av — G F P為表 達 G F P報告基 因 的重組 腺伴隨病毒 ， 由本元 正 陽基 因有 限公 司提供 。C o s - 7細 胞和 P 8 1 5細胞 由本室保存 ， B H K一 2 1細胞 由本元正 陽基 因有限公 司提供 ， 培養(yǎng)液分別 為 D ME M、 1 6 4 0和 E a

9、g l e ’ s 培養(yǎng) 液 ， 均加 收 疆 日期 ： 2 0 0 3—1 2—1 7 ： 修 回 日期 ： 2 0 0 4—0 2 —2 0基金項 目： 中國綜合性艾滋病研究項 目( C I P R A ) ； 國家 8 6 3 計劃 ( 編號 ： 2 o 0 1 AA 2 1 5 0 3 1 )作者倩介 ： 余雙慶( 1 9 7 9 一 ) ， 女 ， 安徽人 ， 碩 士研究生 ， 主要研究 新型艾滋病疫苗。E ． m a i l

10、 ： y y u s h q i n g @h o t m a i l ． 1 2 0 1 1 “ 11 0 ％胎 牛血清 。3工具 酶和試 劑 各種 限制性 內(nèi)切 酶 、 T 4DN A連接 酶及 其它工具 酶均 購 自大連 寶生物工 程有 限公 司。 真核轉(zhuǎn) 染試 劑 L i p o f e c t a m i n eM 2 0 0 0和 D MRI E — C、 T R I z o l 試 劑 均 購 自 I n —v i t r

11、 o g e n 公 司 。C T L檢 測 試 劑 盒 C y t o T o xM9 6No n — R a d i o a c —t i v eC y t o t o x i e i t yA s s a y購 自 P r o m e g a公 司； 淋 巴細胞 分 離液 F i c o I l — P a q u eMP L U S購 自 Ame r s h a m 公 司 。 羊 抗 人 g p l 2 0多 抗購 于華美生物

12、公司 ， HR P標 記兔抗 羊 I g G、 F I T C標記羊抗 人 I g G和 H RP標記 羊抗 小 鼠 I g G， 均購 于 中山 生物技 術(shù)有 限公 司。HI V- 1患者 陽性 血清 由本室保 存 。其 它分 析純試 劑 由本所提供 。4 基 因的改造 與合成 按 照哺乳 動物優(yōu)勢密碼子的使用原 則 ， 在不 改變 氨 基 酸 序列 的前 提 下 ， 對野 生 型 g p l 2 0基 因 ( wt g p l 2

13、0 ) 的密碼子進 行 了改 造 ， 通 過全 基 因合成 獲得 了改 造后 基 因 ( mo d g p l 2 0 ) 。本 文 所 用 改 造 后 序 列 由 上 海 生 工 生 物工程技術(shù)服務(wù)有 限公 司合成 。5 改造前后基 因體外 表達 量 的比較 將 wt g p l 2 0和 m o dg p l 2 0插 入 p S N A V 上 E c o RI和 X h oI酶切 位點 ， 構(gòu)建 了p S NA V - wt g

14、 p l 2 0 和 p S N A V - m o d g p 1 2 0 ， 用 L i p o f e c t a mi n e T M2 0 0 0將其瞬時轉(zhuǎn) 染 C o s - 7細 胞 ， 7 2 h后 收獲 細胞 。用 We ste m b l o t 法 比較基 因的體 外表達量。6 重組腺伴隨病毒 ( r A A V) 的構(gòu)建及鑒定 將質(zhì)粒 p S N A V．w t g p l 2 0和 p S N A V— m

15、o d g p l 2 0送 交 本 元 正 陽 基 因 有 限公 司 ，由其包 裝純化重組病毒 r 從 V— w t g p l 2 0和 r 從 Vm o d g p l 2 0 。取純 化 后 的 病 毒 l v a加 入 1 0 0 V a無 菌 水 中 ， 1 0 0 ℃ 加 熱 1 0 ml n ， 使其裂解 ， 取 2 V a 作 為模板 ， 用 P C R方法擴增 插入 的 基 因 片 段 ， 并 設(shè) r A A V —

16、 G F P為 對 照 。7 重組病毒 r A A V - w t g p l 2 0和 r A A V - mo d g p 1 2 0體外表 達的 鑒 定 將 AV — wt g p l 2 0和 r A AV - m o d g p l 2 0按 MOI 為 1 ×1 0轉(zhuǎn)染 B HK 一 2 1 和 2 9 3細胞 ， 并 按 MOI =5 加 人 輔助 病毒 野生型 A d S 增加其表達 ， 轉(zhuǎn)染后 7 2 h 收