結(jié)核桿菌ESAT6基因密碼子優(yōu)化真核載體的構(gòu)建及其免疫效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：（1）構(gòu)建結(jié)核桿菌 ESAT6基因密碼子優(yōu)化核酸疫苗 pVAX1-ESAT6-O和ESAT6天然密碼子核酸疫苗pVAX1-ESAT6。（2）原核表達(dá)ESAT6重組蛋白。（3）評(píng)價(jià) ESAT6基因密碼子優(yōu)化核酸疫苗 pVAX1-ESAT6-O和天然密碼子核酸疫苗pVAX1-ESAT6的免疫效應(yīng)。
　　方法：（1）培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株。（2）從結(jié)核桿菌H37Ra菌株中提取DNA，設(shè)計(jì)引物，以此DNA為模板通過PCR技術(shù)

2、擴(kuò)增ESAT6基因。（3）ESAT6基因與pET42a（+）載體雙酶切后的純化產(chǎn)物在T4連接酶的作用下連接，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET42a(+)-ESAT6，經(jīng)菌落PC R、單雙酶切及DNA測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒是否正確；鑒定正確的陽性菌株，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌 BL21（DE3+）中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，采用 GS T和鎳柱親和層析純化重組蛋白，通過SDS-PAGE和Western blot對(duì)目的蛋白進(jìn)行分析和鑒定，大量純化蛋白,去除內(nèi)毒

3、素并用鱟試劑定性檢測(cè)內(nèi)毒素，便于后續(xù)試驗(yàn)。（4）酶切純化的ESAT6基因和pVAX1空質(zhì)粒經(jīng)T4連接酶連接構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-ESAT6，經(jīng)菌落PCR、單雙酶切及DNA測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒是否正確。（5）按照哺乳動(dòng)物密碼子使用偏好，對(duì)結(jié)核分枝桿菌ESAT6基因進(jìn)行優(yōu)化，使用 GeneOptimizer軟件對(duì) ESAT6基因的氨基酸編碼基因進(jìn)行優(yōu)化，但不改變氨基酸序列。優(yōu)化后的基因序列，由南京金斯瑞生物公司合成，并插入 pVAX1質(zhì)粒

4、。（6）分別大量提取pVAX1-ESAT6-O、pVAX1-ESAT6和pVAX1。首先，體外轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，并通過RT-PCR、間接免疫熒光檢測(cè)其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；其次，經(jīng)肌肉注射并電轉(zhuǎn)染免疫小鼠，免疫組化觀察小鼠骨骼肌瞬時(shí)表達(dá)效果。(7) pVAX1-ESAT6-O、pVAX1-ESAT6和pVAX1肌肉注射并電轉(zhuǎn)染免疫BALB/c小鼠，3次重復(fù)免疫后，取脾臟制備小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng) ESAT6抗原刺激培養(yǎng)后，以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)淋巴

5、細(xì)胞增殖水平和以ELISPOT檢測(cè)分泌IFN-γ的特異性細(xì)胞免疫情況，并以間接ELIS A法檢測(cè)免疫后血清中IFN-γ的水平和相應(yīng)的特異性抗體及特異性抗體動(dòng)態(tài)變化等免疫指標(biāo)。
　　結(jié)果：(1)構(gòu)建的了 pET42 a(+)-ES AT6重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，DNA測(cè)序鑒定結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)與標(biāo)準(zhǔn)株 H37Ra基因組序列及標(biāo)準(zhǔn)株H37 Rv的ES AT6基因序列完全一致。p ET42 a(+)-ES AT

6、6陽性菌經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后，蛋白在E.coli BL21(DE3)工程菌中大量表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析為可溶性表達(dá)，表達(dá)量占菌體蛋白的30.5％。Western blot顯示重組蛋白能與ESAT6單克隆抗體發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)To xinEras erT M去內(nèi)毒素試劑盒進(jìn)行去除內(nèi)毒素處理后，鱟試劑檢測(cè)蛋白內(nèi)毒素為陰性。（2）構(gòu)建的ESAT6天然密碼子核酸疫苗 pVAX1-ESAT6重組質(zhì)粒經(jīng) PCR和雙酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果

7、一致， DNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)插入基因序列與標(biāo)準(zhǔn)H37Rv株基因序列完全一致。（3）獲得了結(jié)核分枝桿菌ES AT6優(yōu)化后的ES AT6基因序列，并全基因合成，構(gòu)建的ES AT6基因密碼子重組質(zhì)粒p VAX1-ES AT6-O經(jīng)PCR和雙酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，DNA測(cè)序結(jié)果經(jīng) BLAST比對(duì)插入基因序列與設(shè)計(jì)的ESAT6優(yōu)化密碼子序列基因序列完全一致。（4）pVAX1-ESAT6-O和 pVAX1-ESAT6重組質(zhì)粒真核細(xì)胞

8、轉(zhuǎn)染后RT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組均有相應(yīng)的mRN A表達(dá)，間接免疫熒光檢測(cè)表明目的基因能在 He la細(xì)胞中表達(dá)蛋白，免疫組化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照和空質(zhì)粒組著色不明顯，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的小鼠骨骼肌纖維內(nèi)均有著色顯著的棕黃色陽性顆粒。（5）免疫后各組小鼠淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pVAX1-ESAT6-O組和pVAX1-ESAT6組PI值顯著高于pVAX1組和NS組(p＜0.01），pVAX1-ESAT6-O組顯著高于pVAX1-ESAT6組

9、(p＜0.05），pVAX1組和NS組無顯著性差異（p＞0.05）。ELISPOT檢測(cè)結(jié)果顯示pVAX1-ESAT6-O組和pVAX1-ESAT6組經(jīng)抗原刺激后分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)與pVAX1組和NS組相比有顯著性差異（p＜0.01），pVAX1-ES AT6-O組與pVAX1-ES AT6組相比有顯著性差異(p＜0.05）。ELISA檢測(cè)免疫后小鼠血清中分泌IFN-γ的水平與ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致。免疫后pVAX1-ES

10、AT6-O組和pVAX1-ESAT6組小鼠血清中特異性 IgG抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而明顯增高，pVAX1組和 NS組則未出現(xiàn)此現(xiàn)象，而且pVAX1-ESAT6-O組和pVAX1-ESAT6組特異性抗體水平顯著高于pVAX1組和NS組(p＜0.01），pVAX1-ESAT6-O組高于pVAX1-ESAT6組(p＜0.05），pVAX1組和NS組無顯著性差異（p＞0.05）。
　　結(jié)論：（1）成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET42a(